GATA-4 M310V 單基因突變參與家族性房間隔缺損的機制研究*

唐胤，韓增強，寒樺，陳彧

GATA-4 M310V 單基因突變參與家族性房間隔缺損的機制研究*

唐胤，韓增強，寒樺，陳彧

目的：在以往發現家族性先天性房間隔缺損 GATA-4 M310V 單基因突變的基礎上，本研究進一步探討該突變導致家族性房間隔缺損的可能機制。

先天性心臟病；GATA-4 基因；基因突變；啟動子活性；蛋白質核定位

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:211.)

先天性心臟病是人類出生缺陷中最常見的畸形，但其病因仍不清楚，目前認為是遺傳因素及環境致畸因素共同作用的結果。研究發現GATA-4 基因等轉錄因子突變是先天性心臟病的重要病因。GATA-4 參與調節心臟結構基因的表達 ,包 括 心 臟 肌 球 蛋 白 重 鏈 -α(α-Myhc)、心肌鈣蛋白 C、心房利鈉肽因子（ANF）等[1,2]，并通過其鋅指結構與其他心臟特異性的轉錄因子如 Nkx2-5、TBX5 等相互作用發揮轉錄調控作用。先天性房間隔缺損是最常見的發育性心臟病之一，GATA-4 等基因突變與房間隔缺損的關聯機制早已得到研究關注[3，4]。2003 年《Nature》第一次報告 GATA-4 基因突變導致的家族性房間隔缺損[5]。我們前期基因篩查全新發現了 GATA-4 基因外顯子 5 區域的點突變（A928G）（M310V）與房間隔缺損相關[6]，而該突變氨基酸恰好位于GATA4蛋白的重要功能結構域——核定位信號（NLS）。GATA-4 基因這一區域的突變少有報道。本研究將進一步探討 GATA-4 M310V 單基因突變導致家族性房間隔缺損的可能機制。

1 資料與方法

表達載體與報告基因載體的構建： 2010-02 選取我們在前期工作中發現的一個先天性房間隔缺損家族（三級親屬成員共 31人中有8例單純性房間隔缺損患者），經我院倫理委員會批準，并經8例單純性房間隔缺損患者知情同意并簽署知情同意書后采集外周血樣，3例單純性房間隔缺損手術患者知情同意并簽署知情同意書后采集少量心肌組織標本。采用 TRIZOL 總核糖核酸（RNA）提取試劑盒（實驗室自備）提取人心肌細胞總 RNA，采用 M-MLV反轉錄酶（Promega 公司）將 RNA 逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA）。以人 RNA 為模板進行聚合酶鏈反應（PCR）反應擴增 GATA-4 目的基因片段及ANF、α-Myhc 啟動子目的片段。設計合成引物信息見表1。反應條件為：預變性 95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 45 s，72℃ 7 min，共 32 次循環。擴增產物回收后純化，行雙酶切反應后將回收的酶切后載體與目的片段進行水浴連接，構建載體依據 STRATAGENE 公司說明書進行定點突變（表1）。

表1 基因目的片段引物序列

α-Myhc、ANF 啟動子活性雙熒光素酶報告系統檢測 :Hela 細胞（實驗室自備 ）培養至 70%～80% 生長密度時，參照 Invitrogen 公司的 LipofectamineTM 2000 說明書，按照不同載體組合（表2）轉染 Hela細胞，培養 48 h 后采用 Promega 公司的雙熒光素酶報告系統、以 pRL-SV40 質粒為內參，進行啟動子活性檢測。每個轉染組合進行5次重復實驗取平均值。

GATA4 蛋 白 細 胞 定 位 實 驗 :將 構 建 好 的pEGFP-GATA4 表達載體（野生型和 A928G 突變型）瞬時轉染大鼠心肌細胞 H9c2（購自 ATCC 公司 ），培養 48 h 后收集細胞進行涂片，固定細胞后采用4',6- 二脒基 -2- 苯基吲哚 (Invitrogen 公司 ）進行細胞核染色，通過觀察綠色熒光蛋白發光的情況，確認GATA4蛋白在細胞內的定位情況。

統計學方法 :采用 SPSS16.0 統計軟件，雙熒光素酶檢測檢測結果用x±s表示，對所測結果進行正態性及方差齊性檢驗，同一野生型或突變型載體不同劑量轉染組內比較采用單因素方差分析，相同表達載體劑量野生型與突變型載體影響效果組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

表2 轉染入 Hela 細胞系的載體組合

2 結果

載 體 構 建 后 進 行 測 序 驗 證，pcDNA3.1-GATA-4、pcDNA3.1-GATA-4（A928G）、pEGFPGATA-4、 pEGFP-GATA-4（A928G）、 及報 告基因 載 體 pGL3-Basic-Myhc-luc、pGL3-Basic-ANF-luc 均驗證構建成功。

雙熒光素酶檢測結果：對于 α-Myhc 啟動子，引入 GATA-4 基因表達載體后，隨著 GATA-4 表達載體濃度的上升，其啟動子活性呈現上升趨勢，差異有統計學意義（P＜0.005）；引入 GATA-4（A928G）突變基因表達載體后，相同 GATA-4 表達載體轉染劑量（100 ng、200 ng）調控的啟動子活性增強，差異有統計學意義（P＜0.005）；但隨GATA-4 突變型表達載體引入量的增加（300 ng），啟動子活性似乎有下降趨勢，但差異無統計學意義（P=0.195）。對于 ANF 啟動子，引入 GATA-4基因表達載體、GATA-4 突變基因表達載體后，啟動子活性變化組間差異及趨勢變化并不明顯（P＞0.05）。表3

GATA-4 M310V 突 變 對 GATA4 蛋 白 定 位的影響：pEGFP-GATA-4（A928G）突變型重組載體轉染后大鼠心肌細胞綠色熒光發光區外周有環形強光帶，且邊界大于藍色熒光視野下細胞核顯色區域。而 pEGFP-GATA-4 野生型重組載體轉染后大鼠心肌細胞綠色熒光視野下發光區域與藍色熒光視野下細胞核顯色區域一致，且綠色熒光視野下發光區域邊緣無環形強光帶。圖1、2

表3 雙熒光素酶檢測結果

圖1 pEGFP-GATA-4（A928G）突變型重組載體轉染后熒光觀察結果。圖2 pEGFP-GATA-4 野生型重組載體轉染后熒光觀察結果。1A、2A:白光視野顯示大鼠心肌細胞直視形態。1B、2B:綠色熒光視野顯示GATA4 蛋白位置。1C、2C:藍色熒光顯示細胞核位置

3 討論

實驗結果顯示，野生型 pEGFP-GATA4 融合蛋白完全定位在細胞核中，突變型 pEGFP-GATA4 融合蛋白有部分定位在細胞核中，但同時也定位在胞核周邊細胞質中。由此推知，定點突變影響了融合蛋白的核定位，即核定位信號區的 M310V 突變影響了 GATA4 蛋白的核定位。

綜上所述，課題實驗證實了 GATA4蛋白對α-Myhc啟動子活性具有量依賴性的正性調控作用，而該突變可能沒有明顯影響 GATA4 蛋白對 ANF啟動子活性的調控。GATA-4 核定位信號區的 M310V突變影響了 GATA-4蛋白的定位功能。

人類 GATA-4 基因屬于 GATA 轉錄因子家族，GATA 結合蛋白家族廣泛存在于各種生物體內 ,是調節細胞生長與分化的重要轉錄因子[7]，大量研究證實了 GATA-4 是維持心血管系統發育的關鍵性轉錄因子[8]。目前已發現 GATA-4 突變與多種先天性心臟疾病相關，如房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯癥、右心室肥大、心內膜墊缺損[9-11]等。

在心臟發育和心肌活動的不同階段，α-Myhc、ANF 均起到重要作用。有研究報道發現 GATA-4 對于 α-Myhc、ANF 基因具有量依賴性的正性調控作用。本研究結果發現 GATA-4 M310V 突變影響ANF、α-Myhc的程度與效果與先前的報道可能并不一致，推測不同位點的基因突變對 GATA-4 表達調控的意義和影響也可能不同。

核定位信號是親核蛋白均具備的特殊短肽氨基酸序列，是蛋白質通過主動運輸進入核孔的充分必要條件。經典的核定位信號由核心信號及其相鄰的調控序列構成，殘基的組成形式決定信號的強弱，由于重要堿性氨基酸殘基突變或關鍵氨基酸殘基改變引起蛋白構象變化而導致核定位信號不能有效暴露可導致核定位信號區被覆蓋，進而影響蛋白的入核移位功能[12]。本研究結果也確實發現 GATA-4 M310V 突變導致部分 GATA4 蛋白未能定位入核， GATA4 蛋白入核量減少后影響心肌細胞及心臟結構調控導致心臟發育缺陷的機制有待進一步研究。

最近，Ieda 等[13]報 道應 用包 含 Gata4、Mef2c、和 Tbx5（GMT）轉錄組信息的逆轉錄病毒載體注射感染大鼠心臟心肌梗死區域，可誘導纖維母細胞轉化 為 心 肌 樣 細 胞。Ahuja 等[14]報 道 以 GATA-4 基因為靶向目標的姜黃素將有可能起到抑制心肌肥厚的治療作用。因此，轉錄因子 GATA-4 等調控心肌結構與心臟發育的機制有重要意義和廣闊的應用前景，有可能為先心病臨床診斷、基因治療藥物的開發或直接應用轉錄因子進行先心病的基因治療等提供新的分子生物學信息和突破口。而 GATA-4 M310V 核定位區突變作為一種新 GATA-4 突變致先心病機制，其參與心肌結構發育與心臟功能的通路和機制具有重要意義，值得深入研究。

綜上所述，課題實驗證實了 GATA4 蛋白對α-Myhc啟動子活性具有量依賴性的正性調控作用，GATA-4 M310V 突變可能改變了其對 α-Myhc 啟動子活性調控的趨勢，而該突變可能沒有明顯影響GATA4 蛋白對 ANF 啟動子活性的調控。GATA-4 核定位信號區 M310V 突變影響了 GATA4 蛋白的定位，使全部定位于細胞核的GATA4蛋白部分定位于核周的細胞質中，可能是該突變導致家族性先天性房間隔缺損的重要分子生物學機制。GATA4 M310V 突變引起 GATA4蛋白核定位改變及進一步影響心肌細胞結構調控的機制有待深入研究明確。

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Molecular Mechanism Study on GATA-4 M310V Gene Mutation Involved in Patients With Familial Atrial Septal Defect

TANG Yin, HAN Zeng-qiang, HAN Hua, CHEN Yu.

Department of Cardiac Surgery, Peking University People’s Hospital, Beijing (100044), China Corresponding Author: CHEN Yu, Email: chenyu@pkuph.edu.cn

Objective： Based on known gene mutation of GATA-4 M310V in familial congenital atrial septal defect (ASD), we further explored the possible molecular mechanism of these mutations involved in patients with familial ASD.Methods： A total of 31 subjects from one ASD family were studied, 8 of them suffered from ASD. The peripheral blood sample and small amount of myocardial tissue were collected from patients, and both wild type and mutant type GATA-4 expression vectors were constructed, then different vector-combination were transfected into Hela cell lines in vitro. The influences of GATA-4 mutation on α-Myhc and ANF promoters were examined by Dual luciferase reporter assay system. The effect of GATA-4 M310V mutation on GATA-4 protein nuclear location was measured by Green fluorescent protein location method.Results： Dual luciferase reporter assay presented that for α-Myhc promoter, its activity increased accordingly with the increased GATA-4 vector concentrations, P＜0.05. With trasfected GATA-4 (A928G) mutation vectors (100ng, 200ng)the corresponding GATA-4 controlled promoter activity increased accordingly, P＜0.005. While with more GATA-4 mutation vector (300ng) trasfected, the promoter activity seemed to decrease but no statistic meaning, P=0.195. For ANF promoter, with transfected GATA-4 vector and GATA-4 mutation vector, its activity changes was not significantly, P＞0.05.Conclusion： GATA-4 M310V gene mutation affects α-Myhc promoter activity and GATA-4 protein nuclear location, which might be an important molecular mechanism for patients who suffering from familial congenital ASD.

Congenital heart disease; GATA-4 gene; Gene mutation; Promoter activity; Protein nuclear location

2012-12-18）

（編輯：王寶茹）

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國家自然科學基金資助項目（項目號：81041004）

100044 北京市，北京大學人民醫院 心臟中心 心外科

唐胤 住院醫師 博士 主要從事心外科方面研究 Email:tangyin39@163.com 通訊作者：陳彧 Email:chenyu@pkuph.edu.cn

R54

A

1000-3614（2013）03-0211-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.015

方法：選取一個先天性房間隔缺損家族（三級親屬成員共 31 人中有 8 例單純性房間隔缺損患者），采集外周血樣，采集少量心肌組織標本。體外成功構建 GATA-4基因野生型及突變型真核表達載體并轉染細胞系，按照不同載體組合（16 種組合 ）轉染 Hela 細胞，應用雙熒光素酶報告系統檢測 GATA-4 基因突變對心臟肌球蛋白重鏈 -α(α-Myhc)、心房利鈉肽因子（ANF）啟動子活性的影響。應用綠色熒光蛋白定位法檢測 GATA-4 M310V 突變對 GATA4 蛋白核定位的影響。

結果：雙熒光素酶檢測結果：對于 α-Myhc 啟動子，引入 GATA-4 基因表達載體后，隨著 GATA-4 表達載體濃度的上升，其啟動子活性呈現上升趨勢，差異有統計學意義（P＜0.005）；引入 GATA-4（A928G）突變基因表達載體后，相同 GATA-4 表達載體轉染劑量（100 ng、200 ng）調控的啟動子活性增強，差異有統計學意義（P＜0.005）；但隨GATA-4 突變型表達載體引入量的增加（300 ng），啟動子活性似乎有下降趨勢，差異無統計學意義（P=0.195）。對于ANF 啟動子，引入 GATA-4 基因表達載體、GATA-4 突變基因表達載體后，啟動子活性變化組間差異及趨勢變化并不明顯（P＞0.05）。

結論：GATA-4 M310V 突變影響了 α-Myhc 啟動子活性及 GATA4 蛋白的核定位，該突變對 GATA4 蛋白核定位的影響可能是該突變導致家族性房間隔缺損新的重要分子生物學機制。