彎曲桿菌多重PCR檢測(cè)方法的建立

張騰飛 詹麗超 羅玲等

摘要：根據(jù)彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死性膨脹毒素cdtABC操縱子核酸序列，針對(duì)cdtA、cdtB、cdtC設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)特異性引物，用于建立空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌和彎曲桿菌屬細(xì)菌的多重PCR檢測(cè)方法。試驗(yàn)證明，建立的多重PCR檢測(cè)方法能鑒定彎曲桿菌屬細(xì)菌，并區(qū)分出空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌。該方法具有較好的特異性與敏感性，適合在實(shí)驗(yàn)室對(duì)彎曲桿菌進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。

關(guān)鍵詞：彎曲桿菌；PCR檢測(cè)方法

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.612 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2013）09-0008-02

彎曲桿菌病已經(jīng)成為危害食品安全的重要食源性人獸共患病，其病原主要為空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌等彎曲桿菌屬的細(xì)菌。彎曲桿菌為野生、家養(yǎng)動(dòng)物的正常寄居菌，其中家禽為重要宿主之一，該菌在腸道內(nèi)有大量細(xì)菌，感染的動(dòng)物通常無(wú)明顯病癥，但可長(zhǎng)期向外界排菌，通過(guò)排泄物等污染食物和飲水，從而引起人類(lèi)感染，造成成人和兒童腹瀉[1，2]。

利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)與生化鑒定方法對(duì)彎曲桿菌進(jìn)行分類(lèi)與鑒定比較困難與繁瑣，因此有必要開(kāi)發(fā)一種新的鑒定方法來(lái)鑒定彎曲桿菌。

PCR等分子生物學(xué)檢測(cè)方法目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用到細(xì)菌的分離鑒定之中，其中多重PCR在一個(gè)反應(yīng)中能同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)片段，可以方便、快捷的鑒定與區(qū)分多個(gè)菌種。

細(xì)胞致死性膨脹毒素是由cdtABC操縱子編碼，是彎曲桿菌重要的毒力因子之一[3]，但是序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)彎曲桿菌屬中各菌種之間cdtABC操縱子存在著一定的序列差異，本研究根據(jù)菌種之間序列的保守區(qū)與差異區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了鑒定與區(qū)分空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌和彎曲桿菌屬細(xì)菌的多重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33291、結(jié)腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43478均購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心，臨床分離菌株由實(shí)驗(yàn)室保存。空腸彎曲桿菌與結(jié)腸彎曲桿菌均使用mCCDA固體平板或布氏肉湯在42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

rTaq酶、dNTPs、DNA maker、細(xì)菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；改良CCD瓊脂（mCCDA）、mCCDA添加劑購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；布氏肉湯購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；微需氧產(chǎn)氣袋和厭氧罐購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考NCBI上的空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌和彎曲桿菌屬其他菌株的全基因組序列，根據(jù)編碼細(xì)胞膨脹毒素的cdtABC操縱子上的基因cdtA、cdtB、cdtC在各個(gè)彎曲桿菌屬細(xì)菌的差異，針對(duì)cdtA設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增空腸彎曲桿菌的引物一對(duì)，針對(duì)cdtB設(shè)計(jì)可擴(kuò)增彎曲桿菌屬細(xì)菌的通用引物，針對(duì)cdtC設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增結(jié)腸彎曲桿菌的特異性引物。

1.4 模板的制備

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，并進(jìn)行適當(dāng)稀釋后作為PCR的模板；或者取固體平板上的單菌落，經(jīng)超純水重懸后沸水浴5 min，12 000 r/min離心5 min，冰上放置5 min，取上清作為PCR模板。

1.5 單重PCR擴(kuò)增與測(cè)序

將每對(duì)引物分別以空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為模板進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切下DNA片段，使用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6 多重PCR

經(jīng)過(guò)梯度摸索dNTPs的濃度、Mg2+的濃度、Tm值，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；然后95 ℃ 45 S，56 ℃ 45 S，72 ℃ 45 S，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)

經(jīng)過(guò)彎曲桿菌屬新基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，彎曲桿菌屬細(xì)菌均含有編碼細(xì)胞膨脹毒素的cdtABC操縱子，但是各菌種之間cdtABC操縱子的核苷酸序列存在一定的差異。根據(jù)保守區(qū)和差異區(qū)，我們分別設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增空腸彎曲桿菌cdtA基因片段的引物cdtAF、cdtAB，特異性擴(kuò)增彎曲桿菌屬細(xì)菌cdtB基因片段的引物cdtBA、cdtBB，特異性擴(kuò)增結(jié)腸彎曲桿菌cdtC基因片段的引物cdtCF、cdtCB，引物序列見(jiàn)表2。

2.2 單重PCR驗(yàn)證引物

以空腸彎曲桿菌基因組為模板，引物cdtAF、cdtAB與引物對(duì)dtBF、cdtBB分別擴(kuò)增出596 bp和467 bp的片段，經(jīng)測(cè)序與空腸彎曲桿菌cdtA與cdtB基因同源性均達(dá)99%以上，引物cdtCF、cdtCB未能擴(kuò)增出條帶。以結(jié)腸彎曲桿菌基因組為模板，引物對(duì)cdtBF、cdtBB與引物對(duì)cdtCF、cdtCB分別擴(kuò)增出467 bp與313 bp的片段，經(jīng)測(cè)序與結(jié)腸彎曲桿菌cdtB、cdtC基因均達(dá)99%以上，引物對(duì)cdtAF、cdtAB未能擴(kuò)增出條帶。

2.3 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

以空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將dNTP濃度從0.15 ～0.3 mmol/L以0.05 mmol/L為梯度遞增，確定dNTP濃度為0.2 mmol/L時(shí)擴(kuò)增效果較好；再將Mg2+濃度從1～3 mmol/L以0.5 mmol/L為梯度遞增，確定Mg2+濃度為1.5mM時(shí)擴(kuò)增效果較好。最后將Tm值從54～57 ℃以0.5 ℃為梯度遞增，確定56 ℃時(shí)擴(kuò)增效果較好。

多重PCR優(yōu)化后擴(kuò)增結(jié)果如下圖所示，空腸彎曲桿菌與結(jié)腸彎曲桿菌混合菌液可以擴(kuò)增出3條目的帶，分別為596 bp、467 bp和313 bp；結(jié)腸彎曲桿菌菌液可以擴(kuò)增出467 bp和313 bp 兩條目的帶；空腸彎曲桿菌菌液可以擴(kuò)增出596 bp和467 bp兩條帶；分離的其他彎曲桿菌屬細(xì)菌只能擴(kuò)增出467 bp的一條帶。

2.4 多重PCR的特異性與靈敏性

通過(guò)對(duì)空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌、分離的彎曲桿菌屬細(xì)菌和其他標(biāo)準(zhǔn)菌株（包括大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、副雞禽桿菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌等）進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除了彎曲桿菌屬細(xì)菌能擴(kuò)增出特異性條帶，其他陰性參照菌株均沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，該結(jié)果顯示多重PCR的特異性良好。

空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)42 ℃液體培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行梯度稀釋和活菌計(jì)數(shù)，且每個(gè)梯度取1mL菌液制備模板進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果顯示本方法對(duì)于空腸彎曲桿菌的檢測(cè)靈敏度達(dá)到120 CFU，對(duì)于結(jié)腸彎曲桿菌的檢測(cè)靈敏度達(dá)到100 CFU。

3 討論

彎曲桿菌是一種食源性人畜共患病病原菌，是當(dāng)今引起人類(lèi)急性腸胃炎的主要病原之一。在美國(guó)，彎曲桿菌性腸炎每年導(dǎo)致近200萬(wàn)人發(fā)病，超過(guò)了志賀氏菌和沙門(mén)氏菌感染發(fā)病的總和[4]。彎曲桿菌屬細(xì)菌中空腸彎曲桿菌與結(jié)腸彎曲桿菌是最常見(jiàn)的強(qiáng)致病性的菌種。家禽特別是雞群為彎曲桿菌的主要宿主之一，通常成年雞感染彎曲桿菌無(wú)明顯癥狀，然而食入彎曲桿菌污染的雞肉制品等，極易引起人類(lèi)感染，導(dǎo)致急性腸胃炎，隨后還可以引起自身免疫性并發(fā)癥，如格巴氏綜合征和關(guān)節(jié)炎[5]。從家禽養(yǎng)殖開(kāi)始檢測(cè)與防范彎曲桿菌，是從根源上預(yù)防彎曲桿菌病的必要手段。

彎曲桿菌病預(yù)防從檢測(cè)開(kāi)始，常規(guī)的微生物學(xué)程序?qū)澢鷹U菌進(jìn)行分離鑒定是一個(gè)繁瑣和費(fèi)時(shí)的工作。而且彎曲桿菌培養(yǎng)條件苛刻，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法檢出率也很不穩(wěn)定，因此需要快速、高效的檢測(cè)方法。通過(guò)序列比對(duì)與分析，我們針對(duì)cdtA、cdtB和cdtC設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，建立了彎曲桿菌多重PCR檢測(cè)方法，其中擴(kuò)增cdtB的引物為檢測(cè)彎曲桿菌屬通用，可鑒定彎曲桿菌屬細(xì)菌，而擴(kuò)增cdtA和cdtC的引物分別為空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌特異性的，可從彎曲桿菌屬中區(qū)分兩者。特異性和敏感性試驗(yàn)顯示該方法特異性檢測(cè)出彎曲桿菌，并能區(qū)分空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌，而且最低檢測(cè)限分別達(dá)到120 CFU和100 CFU。

該方法能夠應(yīng)用到食品中彎曲桿菌的污染調(diào)查，也能夠應(yīng)用到家禽等動(dòng)物彎曲桿菌感染的疾病診斷與流行病學(xué)調(diào)查，為彎曲桿菌的檢測(cè)與鑒定提供了有效的手段，也為彎曲桿菌的防范提供了工具。

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