歐李SRAP反應體系的建立與優化

郜旭芳　時軍霞

摘 要：采用正交試驗設計，對影響歐李SRAP反應體系的5個因素（模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶）、4個水平進行優化。結果表明，適合歐李的SRAP反應體系為：2.50 mmol/L Mg2+ ，0.25 mmol/L dNTPs，0.60 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶0.50 U，1.00 ng/μl模板DNA，總體積為20 μl。優化體系的建立為今后利用SRAP標記技術對歐李進行種質遺傳多樣性評價、指紋圖譜構建、基因組分析、分子標記輔助育種和遺傳改良等研究奠定了基礎。

關鍵詞：歐李；SRAP；正交設計；優化

中圖分類號：S662.502.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）09-0009-03

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為懷柔湯河口采摘的野生歐李幼嫩葉片，液氮處理后，保存于-20℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用改良的CTAB方法提取DNA[7]，紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。-20℃保存備用。

1.2.2 正交設計 采用L16（45）正交試驗設計，對SRAP反應體系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶濃度進行正交組合方案篩選（表1、表2）。SRAP引物由英駿生物技術有限公司合成，所用引物為：正向引物me2： 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′， 反向引物em1：5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′[8]。

1.2.3 PCR擴增 反應體系為20 μl，擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠（EB）染色后于凝膠成像系統采集圖像。

1.2.4 反應體系穩定性檢測 選用篩選出的引物對不同的野生歐李材料進行SRAP擴增，檢測優化體系的穩定性。

2 結果與分析

2.1 歐李SRAP正交反應體系優化

正交試驗設計SRAP-PCR反應體系選取me2/em1為引物，以野生歐李基因組DNA為模板進行擴增，結果見圖1。

2.2 優化體系驗證

選用篩選出的引物組合me2/em1和優化的反應體系對不同歐李野生植物材料進行擴增。由圖2可知，擴增出的條帶清晰、多態性強、穩定性好，說明該正交體系適宜歐李SRAP-PCR擴增。

1～11：不同野生歐李樣品

圖2 11種野生歐李SRAP優化體系擴增結果

3 討論

SRAP作為一種新型的分子標記，具有操作簡單、穩定、高效等特點，適用于遺傳圖譜構建、基因定位、基因克隆等遺傳操作，目前，已在小麥、水稻、牡丹、西瓜、蘋果、棉花、柑橘、櫻桃、葡萄、柿等植物中應用[13～15]。SRAP-PCR擴增一般需要參考Li和Quiros的固定程序[16]，但其擴增結果受到反應條件、擴增程序及不同物種的影響[17]，所以，SRAP在不同的物種上應用需要進行反應體系的優化。目前，在歐李分子標記的研究中尚未見SRAP應用的報道，因此，探索適合該物種的最佳SRAP-PCR反應體系至關重要。

試驗結果表明，歐李SRAP-PCR擴增的最佳反應體系為2.50 mmol/L Mg2+ ，0.25 mmol/L dNTPs，0.60 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶0.50 U， 1.00 ng/μl模板DNA，總體積為20 μl。本試驗優化的SRAP-PCR反應體系穩定可靠、擴增結果多態性好，不僅適用于歐李基因組DNA的SRAP-PCR擴增，也為SRAP技術在歐李種質資源鑒定和遺傳多樣性分析等方面的研究奠定了基礎。

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