不同因素對大蒜未受精子房愈傷組織誘導的影響

劉穎穎　劉世琦　馬桂芹等

摘 要：以大蒜未受精子房為試材，研究基因型、子房發育時期、低溫預處理、短期熱激處理對大蒜未受精子房愈傷組織誘導的影響。結果表明，在B5+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA培養基上培養的6個大蒜品種中，糙蒜品種子房愈傷組織的誘導率最高；開花當天為最佳誘導時期；低溫4℃處理4 d誘導效果最佳；35℃熱激處理48 h可顯著提高愈傷組織誘導率，但熱激處理易使材料發生褐化，褐化率均在60%以上。

關鍵詞：大蒜；未受精子房；愈傷組織；基因型；溫度

大蒜是中國傳統出口蔬菜產品，在國際市場上享有極高信譽，產品多年暢銷不衰[1，2]。隨著技術貿易壁壘的日益顯現，對大蒜品質的要求越來越高[3]，但由于大蒜多采用無性方式繁殖，病毒逐代積累，容易導致品種種性退化[4]，為此，采取有效措施盡快培育出適合國際市場需求的大蒜新品種勢在必行。

利用作物未受精胚珠或子房進行離體培養誘導雌核發育，可獲得單倍體或雙單倍體植株，進而獲得純合系[5]。單倍體可用來部分固定雜種優勢，擴大可利用的基因資源，加快育種進程[6]。與花藥培養一樣，利用子房進行離體培養誘導雌配子體產生單倍體植株在單倍體育種上具有重要意義[7]。20世紀70～80年代，Uchimiya等（1971）利用未傳粉的玉米（Zea mays L.）子房和茄子（Solanum melongena L.）胚珠誘導出愈傷組織，并觀察到其中有單倍體細胞的分裂，表明雌配子體人工誘導單倍體植株是可能的[8]。在蔬菜雌核誘導單倍體的研究中，黃瓜和西葫蘆的未受精胚珠培養技術已較為成熟[9]。蔥屬植物中已從洋蔥[10～12]、韭菜[13]、百合[14]未授粉子房或胚珠培養出單倍體植株。關于大蒜未受精胚珠與子房培養的研究尚未見報道。本試驗旨在通過研究大蒜基因型、子房發育時期、溫度等因子對未受精子房離體培養的影響，優化大蒜子房離體培養技術體系，為建立高效大蒜未受精子房離體培養再生植株技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗大蒜取自山東農業大學園藝科技創新園。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜未受精子房離體培養 切取田間生長中后期的蒜薹，流水沖洗1～2 h，75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗2～3次，4%次氯酸鈉消毒35 min，最后用無菌水沖洗3～5次。切去蒜薹最下端并放入裝有液體MS培養基（含30 g/L蔗糖）的大試管中培養，4～6 d后，無菌條件下剝除膨大的氣生鱗莖繼續培養。接種前剝去花瓣及雄蕊，將生長良好、大小一致的子房接種到B5+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA培養基（培養基中添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH 5.8）中誘導愈傷組織。組培室光照條件為2 600 lx，16 h/d，室溫為（25±2）℃。

1.2.2 基因型的影響 選取糙蒜、二水早、蒲棵、正月早、紅七星、二秀早6個不同品種的花蕾，在開花前2～3 d，剝除花瓣及雄蕊，獲得大蒜子房接種于誘導培養基中，轉移至光照組培室培養。

1.2.3 子房發育程度的影響 選取糙蒜、蒲棵、正月早3個品種的花蕾，分別在開花前6～7 d、開花前2～3 d、開花當天將花瓣與雄蕊剝除，獲得大蒜子房并接種于誘導培養基中，轉移至光照組培室培養。

1.2.4 低溫預處理的影響 以糙蒜、正月早兩個品種的花蕾為試材，在開花前2～3 d將其移至0～4℃的冰箱中，低溫預處理0（CK）、1、2、4、6 d，處理結束后將子房接種到誘導培養基中，轉移至光照組培室培養。

1.2.5 熱激處理的影響 將糙蒜、正月早兩個品種的大蒜子房接種后，置于35℃的恒溫培養箱中熱激處理0（CK）、12、24、36、48 h，之后移至光照組培室繼續培養。

1.3 數據統計

子房接入誘導培養基后，每隔3 d觀察一次，60 d后統計愈傷組織形成數。每個處理重復3次，每次接種外植體個數約為50個。試驗數據采用DPS 6.55和Excel 2003進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同基因型對愈傷組織形成的影響

由表1可知，在本試驗供試的6個材料中，糙蒜、正月早兩個品種間差異不顯著；紅七星、蒲棵、正月早三個品種間差異不顯著；二季早、二水早兩個品種間差異不顯著。其中，子房愈傷組織誘導率最高的為糙蒜，可達11.11%，二水早最低，為0，二者差異極顯著。說明基因型對大蒜子房愈傷組織誘導率有一定的影響，基因型不同，子房愈傷組織誘導率不同。

2.2 子房不同發育時期對愈傷組織形成的影響

由表2可知，從未受精子房愈傷組織誘導率來看，3個品種均以開花當天為最高，開花前6～7 d

為最低，二者差異極顯著。其中糙蒜、蒲棵開花當天與開花前2～3 d的子房愈傷誘導率沒有顯著差異，但都顯著高于開花前6～7 d的子房愈傷組織誘導率；正月早3個時期的子房愈傷誘導率之間均有顯著差異。

2.3 不同低溫預處理時間對愈傷組織形成的影響

由表3可知，經4℃低溫處理的大蒜未受精子房，在0～4 d內，愈傷組織誘導率隨低溫時間的延長而增大，超過4 d誘導率下降。低溫處理4 d的子房愈傷組織誘導率達到最大，糙蒜和正月早分別為15.65%、11.25%，與不經低溫處理的子房愈傷組織誘導率呈極顯著差異。由此可見，低溫處理能顯著提高大蒜未受精子房愈傷組織誘導率。

2.4 不同短期熱激處理時間對愈傷組織形成的影響

從表4可以得出，從愈傷組織的誘導率來看，糙蒜經過35℃處理12、24、36 h的子房愈傷組織誘導率略有提高，但與其它兩個處理差異不顯著；熱激處理48 h比未經熱激處理的子房愈傷組織誘導率顯著提高。正月早經熱激處理后誘導率有所提高，其中處理12、24、36 h與未經熱激處理的子房愈傷組織誘導率差異不顯著；處理48 h比其它處理的子房愈傷組織誘導率顯著提高。從外植體的褐化程度來看，未經熱激處理與經過熱激處理的外植體之間差異極顯著，兩個品種未經熱激處理的外植體均未發現褐化現象，經過熱激處理的外植體，隨熱激時間的增加，褐化率增大，不論熱激處理時間長短，褐化率均在60%以上，褐化現象嚴重。

3 結論

未受精胚珠或子房離體培養誘導雌核發育產生單倍體植株是國內外探索的新課題。本研究顯示，大蒜未受精子房離體培養10 d左右子房開始膨大，經過50 d左右子房內部開始形成淡綠色的顆粒狀愈傷組織并脹破子房壁，后愈傷組織逐漸膨大變成淡黃色。影響未受精胚珠與子房離體培養的因素很多，如植物的基因型、外植體的發育程度、接種前預處理、培養基、培養條件等[15]。

基因型是影響子房離體培養的重要因素之一。不同的基因型胚狀體誘導率差異很大[16]。閻華等在向日葵未受精胚珠培養中觀察到不同品種在培養中的差異十分顯著[17]。朱獻輝研究表明，在辣椒子房培養中不同基因型之間愈傷組織誘導率存在顯著差異[18]。多次研究表明，不同基因型洋蔥的誘導率差異明顯[12，19，20]。在大蒜子房培養中，不同基因型之間也存在較為明顯的差異。一般認為，不同基因型之間存在誘導率的差異是受遺傳調控的影響。

子房發育時期對于誘導愈傷組織起至關重要的作用。謝冰等對西葫蘆未受精胚珠離體培養誘導結果表明，西葫蘆成熟以及接近成熟的胚囊對人工誘導條件比較敏感，而成熟后的胚囊成員細胞在離體條件下較難啟動分裂[21，22]。陳學軍等提出開花當日西葫蘆未受精胚珠活力較高，其愈傷組織誘導率也最高[23]。本試驗對糙蒜、蒲棵、正月早3個品種研究表明，未受精子房愈傷組織的誘導率與子房發育程度有關，開花當天的子房愈傷組織誘導率最高，分析可能是由于開花當天子房內源激素的濃度較高，利于愈傷組織的誘導。

低溫、高溫等預處理方式，目的是從生理生化上改變細胞的生理狀態、改變其分裂方式和發育途徑。前人研究表明，對花蕾或子房進行有效的預處理，能改變胚胎的發育途徑，促進胚狀體及愈傷組織的形成[24]。Gürel等[25]研究表明，低溫處理對甜菜未受精胚珠離體培養起到明顯的促進作用。而Metwally等[26]研究表明，不經低溫預處理的胚珠愈傷誘導率最高。本研究顯示低溫（4℃）處理4 d最利于提高大蒜未受精子房愈傷組織誘導率。由此可見，不同植物的子房培養對低溫預處理的反應不同。熱激處理對子房培養有一定的影響。王璐等[5]研究表明，熱激處理有利于提高黃瓜未受精子房培養過程中的雌核誘導率。郭永強[27]、徐靜[28]在對西葫蘆未受精胚珠雌核誘導的研究中發現，35℃黑暗熱激處理5 d對啟動西葫蘆未受精胚珠雌核發育有效。本試驗研究表明，熱激處理可提高大蒜子房愈傷組織誘導率，其中35℃處理48 h誘導率明顯提高，但熱激處理易使材料發生褐化，且時間越長，褐化率越高。分析可能是由于高溫處理提高了外植體中多酚氧化酶的活性，促進了多酚物質的氧化。因此，通過熱激處理來提高大蒜子房愈傷組織誘導率還有待于進一步研究。

本研究通過分析不同因素對大蒜子房離體培養的影響，優化了愈傷組織誘導條件。但對于各處理下形成的愈傷組織是否能夠分化形成再生植株尚不清楚，需要進一步研究。

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