山東常用墊料發(fā)酵菌制劑中有效菌的分析鑒定

王春蕾　曹頂國　李福偉等

摘 要：

選擇山東省內應用范圍廣、宣傳力度大的不同劑型墊料發(fā)酵菌劑，采用微生物培養(yǎng)結合分子生物學的方法分離和鑒定其中的好氧發(fā)酵菌，并對其進化關系做了初步分析。結果顯示：不同來源的發(fā)酵菌劑中主要有效菌均為芽孢桿菌屬，菌種數量在108個/g以上，其有效菌間遺傳進化關系很近，同源性都在99%以上；紅糖水培養(yǎng)對發(fā)酵菌劑E、F的增殖效果不穩(wěn)定，培養(yǎng)液中含菌量都不到108個/g，粉劑型含菌量高且穩(wěn)定、更經濟實用。

關鍵詞：山東??；墊料；發(fā)酵菌劑；有效菌；分析鑒定

中圖分類號：TQ920.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）09-0075-04

菌種是制作發(fā)酵床成功的關鍵因素。目前，山東省內用于墊料發(fā)酵的菌制劑來源復雜，劑型多樣。從劑型看，有袋裝粉劑、瓶裝水劑、瓶裝凍干粉等。其中，袋裝粉劑和水劑可直接拌入墊料中使用，而瓶裝凍干粉劑則需要用紅糖水增殖后使用。從發(fā)酵菌劑來源看，山東省應用較多的商品菌劑包括源自日本的洛東酵素、山東省本地企業(yè)生產的發(fā)酵床專用菌以及廣西、河南等地的一些發(fā)酵床專用菌。有的發(fā)酵菌劑為單一的芽孢桿菌，直接作為墊料接種菌，而大部分菌劑為復合型菌種，標稱的主要成分包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌、光合菌、絲狀真菌、放線菌等有益微生物菌群及其代謝產物（消化酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、氨基酸、維生素等）。不同研究都報道了某一菌種發(fā)酵速度快、效果好[1～3]，還有研究顯示了復合菌種的效果要優(yōu)于單一菌種[4]。然而，墊料的成分和高溫發(fā)酵過程并不適合復合菌劑中部分菌種的代謝繁殖。

為研究墊料發(fā)酵菌劑中的菌種種類、數量和在墊料發(fā)酵過程中的作用，筆者分別選擇山東省內應用范圍廣、宣傳力度大的不同劑型的墊料發(fā)酵菌制劑，采用微生物培養(yǎng)結合分子生物學的方法，分離和鑒定其中的好氧發(fā)酵菌，并對其進化關系做了初步分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山東不同公司的發(fā)酵菌劑A、發(fā)酵菌劑B、發(fā)酵菌劑C，國外進口的發(fā)酵菌劑D，河南不同公司的發(fā)酵菌劑E及其紅糖水稀釋液E0、發(fā)酵菌劑F及其紅糖水稀釋液F0。

1.2 試驗儀器

試管，培養(yǎng)皿，1 000、200 μl移液槍及槍頭，立式高壓滅菌鍋LS-B50L，恒溫培養(yǎng)箱SLI-700，超凈工作臺SW-CJ-1F，酒精燈，試管架，電子天平，1 L三角瓶，藥匙。

1.3 試驗方法

制備酵母膏蛋白胨（LB）培養(yǎng)基[5]、PDA培養(yǎng)基[6]、高氏1號培養(yǎng)基[5]、亞硝化細菌培養(yǎng)基[7]、光合細菌液體培養(yǎng)基[8]和溴甲酚綠指示劑培養(yǎng)基[9]，趁熱注入培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。 每種發(fā)酵菌劑稱取0.5 g樣品于100 ml生理鹽水中，搖動10 min后，進行梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8各200 μl分別涂布于待用的培養(yǎng)皿中，每個梯度重復3次，30℃恒溫箱培養(yǎng)，每24 h觀察1次菌落生長狀況并采用科學計數法作記錄。

待培養(yǎng)基上出現(xiàn)微生物菌落并統(tǒng)計完數據后，挑取不同形態(tài)的數個菌落分別在液體培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，待培養(yǎng)1天后，菌液渾濁，單菌長成。此時，用細菌抽提DNA試劑盒對單菌菌液提取純菌DNA，隨后以其DNA為模板、F24和R1492為引物進行PCR擴增，擴增后的PCR產物片段長度在1 500 bp，送濟南力戈有限公司測序，最后將測序結果提交到NCBI網站（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）上的GenBank數據庫登記，用Blast軟件檢索數據庫并進行相似性比較，獲得同源性較高的相關菌株的16S rDNA基因序列，明確具體菌種情況并做DNAstar相似性比較和遺傳進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵菌劑在培養(yǎng)基上的菌落生長狀況

試驗結果表明，所有試驗發(fā)酵菌劑在LB培養(yǎng)基上生長最為旺盛，在亞硝化細菌培養(yǎng)基和光合細菌培養(yǎng)基上不生長；發(fā)酵菌劑C在6種培養(yǎng)基上均無菌落生長；發(fā)酵菌劑D除在LB培養(yǎng)基上生長較好外，在其它培養(yǎng)基上均未見菌落生長；在高氏1號培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后發(fā)酵菌劑A、B、E、F出現(xiàn)較多菌落。從劑型上分析，粉劑型培養(yǎng)得到活菌數量較水劑型更大些，在108個/g以上，發(fā)酵菌劑E0培養(yǎng)菌的數量明顯低于其他菌劑。從活菌數量上，在考慮到試驗操作過程中因缺氧死亡的數量，發(fā)酵菌劑A、B、D、E、F培養(yǎng)的活菌量基本能達到標定的數量（>109個/g），可以在發(fā)酵墊料使用中達到較好的效果（表1）。

2.2 不同發(fā)酵菌劑間優(yōu)勢菌分析鑒定

選取從土壤樣品中提取的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為標準菌，對發(fā)酵菌劑間優(yōu)勢菌序列相似性比較及遺傳進化關系進行分析，結果（圖1、圖2）顯示：發(fā)酵菌劑D在遺傳進化上與枯草芽孢桿菌最近；發(fā)酵菌劑E、發(fā)酵菌劑E0、發(fā)酵菌劑A序列與地衣芽孢桿菌序列相似性較近；發(fā)酵菌劑F、發(fā)酵菌劑F0、發(fā)酵菌劑B的序列與解淀粉芽孢桿菌序列相似性也較高。經分析鑒定，各發(fā)酵菌劑分離得到的優(yōu)勢菌都屬于芽孢桿菌屬，且同源性都在99%以上，遺傳進化關系很近。因此，各發(fā)酵菌劑間的優(yōu)勢菌基本無差別，是所需要的芽孢桿菌屬菌種，適合添加到山東地區(qū)常用墊料中，可放心使用。

2.3 紅糖水培養(yǎng)前的發(fā)酵菌劑與培養(yǎng)后的比較分析

圖3、圖4和表1顯示，同一培養(yǎng)基上，經紅糖水培養(yǎng)后的發(fā)酵菌E0在濃度梯度為10-5上的菌落生長狀態(tài)比發(fā)酵菌E的10-8濃度梯度的狀態(tài)要旺盛些，但相對同一濃度梯度上生長的菌落要低3個數量級；發(fā)酵菌F和F0在同一濃度梯度上的菌落生長狀態(tài)和數量都基本一致。因此，從菌落生長數量上得知，發(fā)酵菌劑E凍干粉直接稀釋培養(yǎng)的菌種生長狀態(tài)比添加紅糖水培養(yǎng)后的效果好些，而發(fā)酵菌劑F凍干粉培養(yǎng)效果與紅糖水增殖后培養(yǎng)效果幾乎無差別。結果表明，紅糖水培養(yǎng)對菌的增殖效果不穩(wěn)定，凍干粉菌劑可直接與墊料混合使用，且活菌含量高、穩(wěn)定、更方便實用。

3 結論與討論

從鑒定的這幾種不同來源的發(fā)酵菌劑分析，發(fā)酵菌劑中主要成分是芽孢桿菌屬，這與王曉霞等（2006）[10]研究發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌具有很強的生物同化作用，能有效改善畜禽養(yǎng)殖環(huán)境的結果是一致的?？梢?，芽孢桿菌屬是發(fā)酵菌制劑中的優(yōu)勢菌。

對于試驗統(tǒng)計的菌落數量，作為驗證菌活力的指標也有一定價值，只是本試驗獲取的數據可能會受各種外界條件的影響而略有偏低，比如，發(fā)酵菌種中的菌多是需氧菌，而在用生理鹽水梯度稀釋中會造成部分菌的死亡，從而影響活菌數量，但每一種發(fā)酵菌劑在LB、PDA、溴甲酚綠指示劑、高氏1號培養(yǎng)基上生長都會受到同樣的影響，活菌數統(tǒng)計結果也存在相似的差值，所以，所得活菌數的結果仍可作為各發(fā)酵菌相互比較的依據。

對于發(fā)酵菌劑D而言，它是比較單一的純菌劑，主要含有固定的一種菌，培養(yǎng)鑒定結果也證實了這一菌劑標稱的主要成分[11]，因此，只在LB培養(yǎng)基上能夠良好的生長。發(fā)酵菌劑F可能因不含有真菌類菌種而不能在PDA培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵菌劑E0、F0分別在高氏1號培養(yǎng)基上未見菌落，可能是由于液體培養(yǎng)使放線菌產生次級代謝產物抑制了放線菌的生長而引起的[12]。

另外，分析滅菌紅糖水對凍干粉菌劑中菌的增殖試驗得知，紅糖水培養(yǎng)對發(fā)酵菌劑E、F的增殖效果不穩(wěn)定，培養(yǎng)液中含菌量都不到108個/g，還增加了紅糖水培養(yǎng)的成本，且這種培養(yǎng)液需要及時使用，才能保證有效活菌數量，否則培養(yǎng)液會因長時間放置導致無活菌存活。

根據菌落的生長狀況分析，袋裝粉劑含菌量要高些，凍干粉次之，加以考慮到培養(yǎng)液的時效，因此，袋裝粉劑和瓶裝凍干粉菌劑可以直接與墊料混合使用，更方便、經濟實用。

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