山東常用墊料發酵菌制劑中有效菌的分析鑒定

王春蕾　曹頂國　李福偉等

摘 要：

選擇山東省內應用范圍廣、宣傳力度大的不同劑型墊料發酵菌劑，采用微生物培養結合分子生物學的方法分離和鑒定其中的好氧發酵菌，并對其進化關系做了初步分析。結果顯示：不同來源的發酵菌劑中主要有效菌均為芽孢桿菌屬，菌種數量在108個/g以上，其有效菌間遺傳進化關系很近，同源性都在99%以上；紅糖水培養對發酵菌劑E、F的增殖效果不穩定，培養液中含菌量都不到108個/g，粉劑型含菌量高且穩定、更經濟實用。

關鍵詞：山東省；墊料；發酵菌劑；有效菌；分析鑒定

中圖分類號：TQ920.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）09-0075-04

菌種是制作發酵床成功的關鍵因素。目前，山東省內用于墊料發酵的菌制劑來源復雜，劑型多樣。從劑型看，有袋裝粉劑、瓶裝水劑、瓶裝凍干粉等。其中，袋裝粉劑和水劑可直接拌入墊料中使用，而瓶裝凍干粉劑則需要用紅糖水增殖后使用。從發酵菌劑來源看，山東省應用較多的商品菌劑包括源自日本的洛東酵素、山東省本地企業生產的發酵床專用菌以及廣西、河南等地的一些發酵床專用菌。有的發酵菌劑為單一的芽孢桿菌，直接作為墊料接種菌，而大部分菌劑為復合型菌種，標稱的主要成分包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌、光合菌、絲狀真菌、放線菌等有益微生物菌群及其代謝產物（消化酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、氨基酸、維生素等）。不同研究都報道了某一菌種發酵速度快、效果好[1～3]，還有研究顯示了復合菌種的效果要優于單一菌種[4]。然而，墊料的成分和高溫發酵過程并不適合復合菌劑中部分菌種的代謝繁殖。

為研究墊料發酵菌劑中的菌種種類、數量和在墊料發酵過程中的作用，筆者分別選擇山東省內應用范圍廣、宣傳力度大的不同劑型的墊料發酵菌制劑，采用微生物培養結合分子生物學的方法，分離和鑒定其中的好氧發酵菌，并對其進化關系做了初步分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山東不同公司的發酵菌劑A、發酵菌劑B、發酵菌劑C，國外進口的發酵菌劑D，河南不同公司的發酵菌劑E及其紅糖水稀釋液E0、發酵菌劑F及其紅糖水稀釋液F0。

1.2 試驗儀器

試管，培養皿，1 000、200 μl移液槍及槍頭，立式高壓滅菌鍋LS-B50L，恒溫培養箱SLI-700，超凈工作臺SW-CJ-1F，酒精燈，試管架，電子天平，1 L三角瓶，藥匙。

1.3 試驗方法

制備酵母膏蛋白胨（LB）培養基[5]、PDA培養基[6]、高氏1號培養基[5]、亞硝化細菌培養基[7]、光合細菌液體培養基[8]和溴甲酚綠指示劑培養基[9]，趁熱注入培養皿中，凝成平板，待用。 每種發酵菌劑稱取0.5 g樣品于100 ml生理鹽水中，搖動10 min后，進行梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8各200 μl分別涂布于待用的培養皿中，每個梯度重復3次，30℃恒溫箱培養，每24 h觀察1次菌落生長狀況并采用科學計數法作記錄。

待培養基上出現微生物菌落并統計完數據后，挑取不同形態的數個菌落分別在液體培養基中進行純培養，待培養1天后，菌液渾濁，單菌長成。此時，用細菌抽提DNA試劑盒對單菌菌液提取純菌DNA，隨后以其DNA為模板、F24和R1492為引物進行PCR擴增，擴增后的PCR產物片段長度在1 500 bp，送濟南力戈有限公司測序，最后將測序結果提交到NCBI網站（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）上的GenBank數據庫登記，用Blast軟件檢索數據庫并進行相似性比較，獲得同源性較高的相關菌株的16S rDNA基因序列，明確具體菌種情況并做DNAstar相似性比較和遺傳進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 發酵菌劑在培養基上的菌落生長狀況

試驗結果表明，所有試驗發酵菌劑在LB培養基上生長最為旺盛，在亞硝化細菌培養基和光合細菌培養基上不生長；發酵菌劑C在6種培養基上均無菌落生長；發酵菌劑D除在LB培養基上生長較好外，在其它培養基上均未見菌落生長；在高氏1號培養基上培養5 d后發酵菌劑A、B、E、F出現較多菌落。從劑型上分析，粉劑型培養得到活菌數量較水劑型更大些，在108個/g以上，發酵菌劑E0培養菌的數量明顯低于其他菌劑。從活菌數量上，在考慮到試驗操作過程中因缺氧死亡的數量，發酵菌劑A、B、D、E、F培養的活菌量基本能達到標定的數量（>109個/g），可以在發酵墊料使用中達到較好的效果（表1）。

2.2 不同發酵菌劑間優勢菌分析鑒定

選取從土壤樣品中提取的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為標準菌，對發酵菌劑間優勢菌序列相似性比較及遺傳進化關系進行分析，結果（圖1、圖2）顯示：發酵菌劑D在遺傳進化上與枯草芽孢桿菌最近；發酵菌劑E、發酵菌劑E0、發酵菌劑A序列與地衣芽孢桿菌序列相似性較近；發酵菌劑F、發酵菌劑F0、發酵菌劑B的序列與解淀粉芽孢桿菌序列相似性也較高。經分析鑒定，各發酵菌劑分離得到的優勢菌都屬于芽孢桿菌屬，且同源性都在99%以上，遺傳進化關系很近。因此，各發酵菌劑間的優勢菌基本無差別，是所需要的芽孢桿菌屬菌種，適合添加到山東地區常用墊料中，可放心使用。

2.3 紅糖水培養前的發酵菌劑與培養后的比較分析

圖3、圖4和表1顯示，同一培養基上，經紅糖水培養后的發酵菌E0在濃度梯度為10-5上的菌落生長狀態比發酵菌E的10-8濃度梯度的狀態要旺盛些，但相對同一濃度梯度上生長的菌落要低3個數量級；發酵菌F和F0在同一濃度梯度上的菌落生長狀態和數量都基本一致。因此，從菌落生長數量上得知，發酵菌劑E凍干粉直接稀釋培養的菌種生長狀態比添加紅糖水培養后的效果好些，而發酵菌劑F凍干粉培養效果與紅糖水增殖后培養效果幾乎無差別。結果表明，紅糖水培養對菌的增殖效果不穩定，凍干粉菌劑可直接與墊料混合使用，且活菌含量高、穩定、更方便實用。

3 結論與討論

從鑒定的這幾種不同來源的發酵菌劑分析，發酵菌劑中主要成分是芽孢桿菌屬，這與王曉霞等（2006）[10]研究發現的芽孢桿菌具有很強的生物同化作用，能有效改善畜禽養殖環境的結果是一致的。可見，芽孢桿菌屬是發酵菌制劑中的優勢菌。

對于試驗統計的菌落數量，作為驗證菌活力的指標也有一定價值，只是本試驗獲取的數據可能會受各種外界條件的影響而略有偏低，比如，發酵菌種中的菌多是需氧菌，而在用生理鹽水梯度稀釋中會造成部分菌的死亡，從而影響活菌數量，但每一種發酵菌劑在LB、PDA、溴甲酚綠指示劑、高氏1號培養基上生長都會受到同樣的影響，活菌數統計結果也存在相似的差值，所以，所得活菌數的結果仍可作為各發酵菌相互比較的依據。

對于發酵菌劑D而言，它是比較單一的純菌劑，主要含有固定的一種菌，培養鑒定結果也證實了這一菌劑標稱的主要成分[11]，因此，只在LB培養基上能夠良好的生長。發酵菌劑F可能因不含有真菌類菌種而不能在PDA培養基上生長，發酵菌劑E0、F0分別在高氏1號培養基上未見菌落，可能是由于液體培養使放線菌產生次級代謝產物抑制了放線菌的生長而引起的[12]。

另外，分析滅菌紅糖水對凍干粉菌劑中菌的增殖試驗得知，紅糖水培養對發酵菌劑E、F的增殖效果不穩定，培養液中含菌量都不到108個/g，還增加了紅糖水培養的成本，且這種培養液需要及時使用，才能保證有效活菌數量，否則培養液會因長時間放置導致無活菌存活。

根據菌落的生長狀況分析，袋裝粉劑含菌量要高些，凍干粉次之，加以考慮到培養液的時效，因此，袋裝粉劑和瓶裝凍干粉菌劑可以直接與墊料混合使用，更方便、經濟實用。

參 考 文 獻：

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