芥藍(lán)離體再生體系的優(yōu)化

范愛麗　黃志鵬等

摘要：以芥藍(lán)（Brassica oleracea）真葉和子葉段為外植體，研究了TDZ濃度、基因型及苗齡等因素對芥藍(lán)不定芽再生的影響。結(jié)果表明，真葉和子葉段的最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為MS+0.50～1.00 mg/L TDZ和MS+0.50 mg/L TDZ，真葉和子葉段再生頻率分別達(dá)到82.56%和89.06%。最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.10 mg/L NAA，其生根率達(dá)到100.00%，再生植株移栽成活率為96.00%。

關(guān)鍵詞：芥藍(lán)（Brassica oleracea）；TDZ；真葉；子葉段；離體再生

中圖分類號：S635.9 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2171-03

芥藍(lán)（Brassica oleracea）是起源于中國南方的一種特產(chǎn)蔬菜[1]，性喜冷涼，秋播冬收，主要食用花薹或嫩株，質(zhì)脆可口，營養(yǎng)豐富且具有抗癌保健功效[2]。近年來全球氣候變暖，高溫脅迫導(dǎo)致芥藍(lán)品質(zhì)劣化、商品率降低。隨著現(xiàn)代育種技術(shù)手段不斷發(fā)展，通過離體誘變或基因工程方法可快速選育出芥藍(lán)耐熱種質(zhì)或品種，提高芥藍(lán)品質(zhì)與產(chǎn)量。芥藍(lán)組織培養(yǎng)是離體誘變和轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)，芥藍(lán)離體再生的外植體有莖段[3-5]、腋芽[6]、下胚軸[7-11]、子葉[12]和帶柄子葉[13]。唐君等[11]將下胚軸經(jīng)苯基噻二唑脲（TDZ）[14]浸泡預(yù)處理，而在培養(yǎng)基中添加高效誘芽激素TDZ對芥藍(lán)真葉離體再生的影響尚未報道。

本研究探討了TDZ濃度、基因型及苗齡等因素對芥藍(lán)不定芽再生的影響，進一步優(yōu)化芥藍(lán)離體再生體系，旨在建立對芥藍(lán)具有較廣泛適應(yīng)性的離體再生體系，為芥藍(lán)無性系離體誘變和轉(zhuǎn)基因進行育種工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以黃花大筍芥藍(lán)（J1）、正源大筍黃花芥藍(lán)（J2）及自主雜交的F1芥藍(lán)（J3）種子為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 挑選子粒飽滿的芥藍(lán)種子，在超凈工作臺上先用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇表面殺菌約1 min，再用10% NaClO溶液滅菌20～25 min，然后用無菌水反復(fù)沖洗4～5次，最后將種子平放于MS固體培養(yǎng)基表面（MS培養(yǎng)基均添加0.7%瓊脂，3%蔗糖，pH 5.8，121 ℃滅菌20 min）。每瓶約10～15粒，放置于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，光照時間16 h/d，光照強度2 000 μmol/（m2·s），獲得的無菌苗供切割外植體用。

1.2.3 不同基因型及苗齡對芥藍(lán)外植體不定芽再生的影響 在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，觀察比較不同基因型芥藍(lán)外植體J1、J2、J3不定芽的再生頻率和再生系數(shù)，培養(yǎng)方法同上；在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別接種最優(yōu)基因型芥藍(lán)的不同苗齡（4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 d）外植體，培養(yǎng)方法同上。

1.2.4 不同濃度NAA對芥藍(lán)外植體不定芽生根的影響 不定芽長到2～3 cm時，轉(zhuǎn)入含有不同濃度NAA（0.00、0.10、0.30和0.50 mg/L）的1/2 MS生根培養(yǎng)基中，20 d后對生根效果進行觀察對比，篩選出最適濃度。待基部形成大量的毛根后，打開三角瓶口，煉苗6～7 d后取出小苗，洗凈根部培養(yǎng)基后移栽到自配基質(zhì)中，30 d后統(tǒng)計成活率，再定植于大田。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TDZ對芥藍(lán)外植體不定芽再生的影響結(jié)果

2.2 不同基因型對芥藍(lán)外植體不定芽再生的影響結(jié)果

在含0.50 mg/L TDZ的培養(yǎng)基中，不同基因型外植體不定芽的再生頻率和再生系數(shù)見表2。由表2可見，J1子葉段的再生頻率最低（73.49%），J2子葉段的再生頻率最高（89.06%）；子葉段再生系數(shù)最高的是J3（3.63）。J2和J3真葉的再生頻率間無顯著差異，但兩者與J1均有顯著差異（P<0.05）；J2真葉再生系數(shù)最高（2.91），與J1有顯著差異（P<0.05）。綜合比較3種基因型外植體的再生頻率和再生系數(shù)，J2（正源大筍黃花芥藍(lán)）為不定芽誘導(dǎo)的最優(yōu)基因型。

2.3 不同苗齡對芥藍(lán)外植體不定芽再生的影響結(jié)果

2.4 不同濃度NAA對芥藍(lán)外植體不定芽生根的影響結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，TDZ既可以促進生根、又可促進形成愈傷組織，也可以直接再生不定芽，且濃度在0.05～1.00 mg/L范圍內(nèi)真葉有較好的再生效果。當(dāng)TDZ濃度為0.50 mg/L，J2子葉段和真葉最高再生頻率分別為89.06%和82.56%，與唐君等[11]下胚軸經(jīng)0.50 mg/L TDZ浸泡30 min，放置于6-BA和NAA的激素組合的最高再生頻率為98.50%，相差不到10.00%，滿足后續(xù)試驗的要求。本研究采用單一激素TDZ誘導(dǎo)芥藍(lán)不定芽，試驗適宜濃度范圍廣且易于操作，相對于前人研究方法簡單，再生頻率較高，再生芽數(shù)多，為芥藍(lán)無性系離體誘變和轉(zhuǎn)基因進行育種工作提供了一定的參考。

參考文獻：

[1] 王冬梅，陳 深，王慶彪，等.一個支持芥藍(lán)起源于中國的分子證據(jù)[J].中國蔬菜，2011（16）：15-19.

[2] 孫 勃，方 莉，劉 娜，等.芥藍(lán)不同器官主要營養(yǎng)成分分析[J].園藝學(xué)報，2011，38（3）：541-548.

[3] WONG K， LOH C. In vitro regeneration of plantlets in Brassica alboglabra[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，1987， 10（2）：143-148.

[4] PUA E C，TRINH T H，CHUA N H. High frequency plant regeneration from stem explants of Brassica alboglabra Bailey in vitro[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1989，17（2）：143-152.

[5] 陳瓊娥，鐘鳳林，林碧英.芥藍(lán)組織培養(yǎng)研究[J].亞熱帶植物科學(xué)，2011，40（1）：34-37.

[6] 黃文華，莊東紅，鄭漢藩，等.芥藍(lán)的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，1999，35（2）：130.

[7] 何亞文，賀 紅.芥藍(lán)下胚軸離體培養(yǎng)及高頻率植株的再生[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報，1998，6（2）：152-157.

[8] 黃 科，余小林，吳秋云，等.芥藍(lán)植株再生體系的優(yōu)化[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2004，26（3）：313-316.

[9] 周 林，曾國平，章崇玲，等.芥藍(lán)的組織培養(yǎng)研究[J].長江蔬菜，2006（8）：45-46.

[10] 秦耀國，楊翠芹，程明軍，等.培養(yǎng)基pH值對芥藍(lán)離體再生的影響[J].中國蔬菜，2010（6）：47-49.

[11] 唐 君，張蜀寧，侯喜林，等.芥藍(lán)高頻離體再生體系的建立[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，34（2）：29-32.

[12] 韋正乙，蔡勤安，林春晶，等.芥藍(lán)組織培養(yǎng)及再生體系的建立[J].生物技術(shù)通報，2009（增刊）：156-158.

[13] 胡志群，江遠(yuǎn)彩，陳 淳.芥藍(lán)子葉離體培養(yǎng)再生植株的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，27（4）：113-114.

[14] 徐曉峰，黃學(xué)林.TDZ：一種有效的植物生長調(diào)節(jié)劑[J].植物學(xué)通報，2003，20（2）：227-237.

[15] 劉學(xué)成，張魯剛，茹 磊，等.大白菜真葉高頻再生體系的建立[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，39（11）：146-152.

[16] 范愛麗，張魯剛，武云霞，等.大白菜子葉段高頻再生體系的建立[J].核農(nóng)學(xué)報，2009，23（4）：581-586.