山羊低氧適應性相關基因的表達量研究

肖驍 字向東等

摘要：為了探討藏山羊低氧生態(tài)適應性的分子調節(jié)機理，采用實時熒光定量PCR技術對藏山羊和樂至黑山羊低氧誘導因子（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF165）及其受體FLT-1和FLK-1基因的表達量進行測定。結果表明，在垂體組織中，樂至黑山羊hif-1α、vegf165和flk-1的mRNA相對表達量分別是藏山羊的1.43倍、1.93倍和4.25倍，差異顯著（P<0.05），flt-1的mRNA相對表達量是藏山羊的1.22倍，無顯著差異（P>0.05）；在肝臟組織中，樂至黑山羊hif-1α、vegf165和flt-1的mRNA相對表達量分別是藏山羊的2.08倍、1.52倍和3.21倍，差異顯著（P<0.05），flk-1的mRNA相對表達量是藏山羊的1.17倍，無顯著差異（P>0.05）。說明經過長期生物進化和環(huán)境選擇，藏山羊對于高原低氧環(huán)境已經表現出明顯的適應性，目的基因的表達量均低于樂至黑山羊。

關鍵詞：藏山羊；實時熒光定量PCR；mRNA表達量；低氧適應性

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2181-04

低氧誘導因子-1（Hypoxia inducible factor-1， HIF-1）是一種能特異性結合于促紅細胞生成素基因的低氧反應原件（HRE）的DNA結合蛋白，它廣泛參與動物細胞中缺氧誘導產生的適應性反應，是細胞適應低氧的重要蛋白轉錄調節(jié)因子[1]。HIF-1是由對氧敏感的α亞基和穩(wěn)定表達的β亞基組成的異源二聚體[2]。作為HIF-1的調節(jié)亞基和活性亞基，HIF-1α決定HIF-1的活性，實現HIF-1的生物效應。低氧環(huán)境下HIF-1α在組織細胞中廣泛表達，在某些基因的啟動子、增強子或其他調控區(qū)也都含有HIF-1α的特異結合序列，這說明在低氧誘導的各種相關基因的表達中HIF-1α起著關鍵作用[2]。

血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是對血管形成具有重要作用的生長因子。它是內皮細胞特異的絲裂素（Mitogen），能夠促進血管內皮細胞有絲分裂的活性。根據VEGF含有氨基酸數量的不同，可以分為VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206

6種亞型[3，4]。其中VEGF165的生物活性最強、含量最多。VEGF有已知的3種受體：VEGFR-1（Fms-like tyrosine kinase，FLT-1），VEGFR-2（Kinase domain region，also referred to as fetal liver kinase，KDR/FLK-1），VEGFR-3（The fms-like tyrosine kinase，FLT-4）[5]。它們均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內區(qū)組成。其中VEGFR-1與VEGF的親和力最強，是VEGFR-2的10倍[6，7]。

藏山羊是我國青藏高原的特有畜種，是一個古老的地方山羊品種，迄今為止已有4 000多年的歷史。它主要分布在西藏、四川、青海和甘肅等海拔1 500～5 000 m的高寒牧區(qū)，具有耐粗飼、抗逆性強的特點，能適應高原地區(qū)各種嚴酷的自然生態(tài)條件，是藏族同胞重要的生產資料和生活資料[8]。樂至黑山羊是四川省樂至縣經過長期選育而成的優(yōu)秀地方品種，主要分布在海拔300～600 m的平原地區(qū)。近年來對與環(huán)境作用相關的功能基因已有越來越深入的了解，關于高原物種環(huán)境適應性的研究也有一些報道。有研究發(fā)現將對高原低氧、低溫環(huán)境有著極強適應能力的高原土著品種藏雞與白來航雞和壽光雞兩個低地品種進行全期模擬低氧孵化，藏雞的孵化率顯著高于兩個低地雞品種，表現出了高度的耐受低氧環(huán)境的能力[9]；將高原鼠兔置于常氧室溫條件下適應7 d，Northern雜交檢測hif-1α mRNA在多種組織中均有表達，并且表現出明顯的組織差異性[10]。本實驗旨在通過采用實時熒光定量PCR技術比較高原藏山羊和平原樂至黑山羊HIF-1α、VEGF165及其受體FLT-1和FLK-1基因的mRNA表達量的差異，進而研究處于高寒低氧地區(qū)動物的環(huán)境適應性和環(huán)境因素對其相關基因表達量的作用及影響，為進一步深入了解環(huán)境因素與基因表達之間的分子機制和調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物 實驗所用的羊只均為健康成年的母山羊，藏山羊來自四川省理縣藏山羊養(yǎng)殖農戶；樂至黑山羊購自四川省樂至縣天龍科技示范園。分別采集藏山羊和樂至黑山羊的垂體和肝臟組織樣本，標記后放入液氮中保存。

1.1.2 試劑及耗材 總RNA提取試劑盒、RNA樣品保存液等購自天根生化科技（北京）有限公司；實時熒光定量試劑盒SsoFastTM EvaGreen Supermix、八聯管及配套管蓋均購自伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司；RT Reagents試劑盒、Ex Taq酶、pMD19-T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒及耗材均購自美國Axygen公司。

1.2 實驗方法

1.2.4 統計分析 應用SPSS 17.0軟件的一般線性模型程序進行數據的分析，采用Pfaffle方法處理數據，分析目的基因的相對表達量。不同實驗組中mRNA相對表達量的差異顯著性通過t-檢驗進行分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA完整性及純度檢測

所提取的藏山羊和樂至黑山羊總RNA經紫外分光光度計檢測，A260 nm/A280 nm均在1.8～2.0之間，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，18 S RNA和28 S RNA條帶清晰可見（圖1），說明所提取的RNA完整性好，無明顯降解，能滿足后續(xù)實驗的要求。

2.2 實時熒光定量PCR擴增結果

2.3 目的基因在2個山羊品種間的相對表達量分析

3 小結與討論

HIF-1α作為缺氧應答的調控因子能夠廣泛激活參與缺氧相關生理反應的眾多基因，是介導缺氧信號與一系列基因的轉錄激活的一個重要偶聯和調控因子，在缺氧的適應性反應中發(fā)揮重要的作用[19，20]。本實驗通過研究高原羊和平原羊之間受環(huán)境因素調控的基因表達量的差異，對其環(huán)境適應性和基因間的相互作用及影響有了更深入的了解，希望能為今后對組織之間表達量差異以及受體作用機制的進一步研究提供理論基礎。

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