EV71感染手足口病患兒細胞及體液免疫功能研究

張海瑛　韓宜姚

[摘要] 目的 探討EV71感染手足口病患兒細胞免疫及體液免疫功能變化。 方法 將92例EV71感染的手足口病患兒分為重型組、輕型組，另選正常健康對照組兒童30例為對照組，檢測各組靜脈血T細胞亞群、B細胞表達情況，免疫球蛋白及補體C3、C4水平及TNF-α、IL-6及IL-10水平。 結果 重型組及輕型組患兒Th及Ts細胞比例降低，B細胞比例升高，TNF-α、IL-6、IL-10水平升高，IgA、IgG、C3、C4水平升高，各組間差異有統計學意義。 結論 EV71感染手足口病患兒存在細胞及體液免疫異常情況，并且同病情相關，臨床檢測有助于病情預測及預后評估。

[關鍵詞] 腸道病毒71；手足口病；細胞免疫；體液免疫；免疫球蛋白

[中圖分類號] R725.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）09-0028-03

手足口病是由腸道病毒感染引起的常見的小兒傳染病，多由腸道薩科奇A型病毒及EV71病毒感染引起，具有較高的傳染性，是我國重點監控的小兒傳染病之一。患兒感染后病毒繁殖引起病毒血癥，并且對組織及器官具有侵襲性，引發患兒的多器官功能損傷，甚至引起功能衰竭，在手、足口等黏膜部位及組織受壓部位，病毒容易聚集、繁殖引起局部組織病變，表現為典型的臨床癥狀，手、足及皮膚黏膜損害。近年來的研究結果顯示[1，2]，在大部分病毒感染疾病中，體液免疫及細胞免疫均參與疾病的進展及組織損傷過程，本研究就EV71感染致病的手足口病患兒體內細胞免疫及體液免疫功能的變化進行研究，為EV71感染手足口病患兒的臨床治療及預后評估提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院兒科2010年2月～2012年3月診斷并治療的EV71病毒感染致病的手足口病患兒92例，患兒年齡0.6～7.8歲，平均（3.2±1.6）歲，其中男52例，女40例，患兒均經PCR核酸檢測明確診斷，病程1～5 d，平均（3.2±1.1）d，并排除使用免疫抑制劑治療、患有結核、其他病毒感染性疾病及免疫疾病患兒，患兒入選后按《手足口病診療指南（2010）》標準分為輕型組及重型組[3]，其中輕型組38例，男22例，女16例，年齡0.6～7.6歲，平均（3.1±1.7）歲，病程2～5 d，平均（3.5±1.3）d，重型組54例，其中男30例，女24例，年齡0.6～7.8歲，平均（3.2±1.5）歲，病程1～5 d，平均（3.0±1.2）d，對照組兒童30例，其中男18例，女12例，年齡1～9歲，平均（3.7±1.8）歲，三組間性別比例、年齡等一般資料差異無統計學意義（P > 0.05）。

1.2 試劑及儀器

1.3 標本檢測

1.3.1 血清炎性介質檢測 各組血清炎性介質TNF-α、IL-6及IL-10檢測采用比色法，患兒抽取清晨空腹靜脈血，低溫離心血清，超低溫冰箱保存，分批檢測，檢測試劑標準品梯度稀釋，蒸餾水空白對照，721型分光光度計檢測各管吸光度，繪制標準曲線，橫坐標為吸光度，縱坐標為樣品濃度，血清標本解融后梯度稀釋至檢測范圍，采用微量加樣器，48孔板每孔加入100 μL標本，以蒸餾水作為空白對照，各組標本加入檢測試劑盒抗體，室溫孵育30 min，依次加入X Biotin和X HRP，充分混勻，加入TMB室溫孵育15 min顯色，采用稀硫酸終止反應，分光光度計測量各孔吸光度，繪制檢測曲線，依據標準曲線計算各檢測樣品檢測物濃度。

1.3.2 IgA、IgG、IgM及C3、C4檢測 IgA、IgG、IgM及C3、C4檢測采用放射免疫法，清晨采集空腹靜脈血，低溫離心得血清，深低溫冰箱保存，標準品梯度濃度稀釋，依次計入一抗及I131標記的二抗后室溫孵育，采用放射免疫 γ 計數儀檢測放射濃度，繪制標準曲線，標本解融后按照上述步驟進行標記檢測，繪制檢測物曲線，依據標準曲線計算檢測標本濃度。

1.3.3 T細胞及B細胞檢測 患兒清晨抽取空腹靜脈血，加入流式細胞儀專用紅細胞裂解液2 mL，室溫震蕩，加入淋巴細胞分離液，室溫震蕩20 min，低速離心淋巴細胞，棄去上清液，淋巴細胞加入PH值為7.0的PBS緩沖液充分洗滌，上機檢測，每個檢測管獲取1000個細胞，采用CD3+抗體標記T細胞，采用CD4+抗體標記Th細胞及Ts細胞，采用CD19+抗體標記B淋巴細胞，檢測完畢后采用Cellquestpro軟件進行分析。

1.4 統計學方法

3 討論

手足口病是病毒感染引起的常見兒童傳染病，手足口病多發病隱匿，傳染性強，多種腸道病毒感染均可引起手足口病，除典型的皮膚及神經系統損害以外，多具有多器官損害的特征，如心肌損害等，重型者死亡率較高，既往研究發現，在手足口病患兒血清及體液中免疫因子及炎性因子表達異常，提示可能免疫過程參與手足口病的發病及進展過程，而且在手足口病患兒體內存在Th細胞免疫漂移現象，Th1向Th2亞群分化導致的免疫抑制是手足口病患兒病情進展的機制之一[4.5]。

多種血清型的腸道病毒感染均能引起手足口病，其中EV71感染所致的手足口病是常見的類型之一，在對EV71感染所致的手足口病患兒研究發現，在患兒體內存在細胞免疫及體液免疫異常情況，患兒感染手足口病后，其體內的Th及Ts淋巴細胞的數量均明顯下降，B細胞數量升高[6]。Th細胞具有誘導免疫細胞活化及應答的作用，是機體維持正常細胞免疫的主要機制之一[7.8]。Ts細胞對Th的活化及B細胞活化具有調節作用，Th及Ts細胞與患者細胞免疫關系最為密切，Th及Ts細胞的下降說明患者細胞免疫功能受到抑制。而且與患兒手足口病的病情程度相關，重癥組患兒細胞免疫抑制情況更為明顯[9，10]。進一步的研究發現，在手足口病患兒體內存在過度炎癥反應現象，TNF-α、IL-6 及IL-10過度表達，TNF-α、IL-6 及IL-10均是由活化的免疫細胞釋放的介質，TNF-α和IL-6具有強烈的導致炎癥反應的作用，能夠導致組織、器官的炎性損傷甚至功能衰竭、組織壞死，同時TNF-α和IL-6對中性粒細胞及巨噬細胞等炎性細胞具有趨化及激活作用，能夠導致局部炎性細胞的聚集及炎癥反應，IL-10主要有Th2細胞、B細胞及巨噬細胞表達的細胞因子，是對T細胞免疫具有調節作用的炎性因子，能夠反饋性抑制Th2細胞的表達，調節Th細胞免疫平衡及抑制過度的免疫反應，IL-10的過度表達提示患者體內存在Th2細胞的過度表達及漂移現象，說明存在細胞免疫的異常。

免疫球蛋白可使補體成分激活及體液免疫增強，研究中發現，患兒體內的IgA、IgG水平及補體C3、C4水平明顯升高。IgA、IgG的表達水平升高說明機體的體液免疫功能增強。IgA、IgG對巨噬細胞及自然殺傷細胞的免疫吞噬作用具有增強作用，IgA尚能夠通過經典途徑激活補體系統，增強機體免疫反應，C3、C4等補體是體內正常表達的肽類分子，通過B細胞等免疫細胞對抗原的提呈作用激活，引起對外來抗原的識別及結合，參與機體的非特異性免疫[11]，研究結果顯示，手足口病患兒存在體液免疫亢進的情況，而且同病情相關，重癥患兒表現更為明顯，其可能是手足口病患兒機體防御的主要表現[12]。既往研究顯示[13]，在手足口病患兒的早期病程中IgM升高，病程第2天以后，IgM的升高的檢出率明顯下降，在檢測過程中發現IgM在手足口病患兒中無明顯變化，可能同患兒的病程有關[14，15]。研究結果顯示，手足口病患兒細胞免疫功能抑制，體液免疫功能激活，同患兒的疾病進展程度相關，其主要原因可能與患兒病情進展及康復的過程體內免疫異常有關。

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（收稿日期：2013-01-22）