RNAi介導(dǎo)Frizzled—9基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG—2增殖和轉(zhuǎn)移的影響

謝宏民　楊新魁　李佳璇??

【摘要】 背景與目的 肝癌（hepatic carcinoma）是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌、食道癌而居第三位。本研究將探索性地研究Frizzled-9在所有的肝細(xì)胞癌中都有表達(dá)，并且表達(dá)多少與肝癌的擴(kuò)散及侵襲相關(guān)，而且，干擾了肝癌細(xì)胞FZ9后，通過Transwell小室模型檢測(cè)被剔除了FZ9基因HepG-2細(xì)胞移動(dòng)能力，為探尋治療胰腺癌的新策略提供思路。方法 應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株HepG-2的FZ9的表達(dá)情況。并應(yīng)用脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染FZ9-siRNA至肝癌細(xì)胞株HepG-2。通過Transwell小室模型分析肝癌細(xì)胞的移動(dòng)、侵襲性。結(jié)果 Frizzled-9特異的siRNA明顯抑制HepG-2細(xì)胞中FZ9及蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較其抑制率為97.6%。轉(zhuǎn)染Frizzled-9-siRNA（5nM）24小時(shí)后對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力有顯著影響（P〈0.05），實(shí)驗(yàn)組較空白組轉(zhuǎn)移及侵襲能力減弱。

【關(guān)鍵詞】 Frizzled-9；RNA干擾（RNAi）；肝癌；細(xì)胞侵襲

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.08.063 文章編號(hào)：1004-7484（2013）-08-4170-01

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.1.1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 采用Hiperfect Transfection Reagent介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)。參閱其產(chǎn)品說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組：HepG-2常規(guī)培養(yǎng)，不予干預(yù)，陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染通用對(duì)照shRNA（HK）或轉(zhuǎn)染帶有熒光標(biāo)記的對(duì)照siRNA，以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效，陽(yáng)性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染GAPDH siRN，實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染Frizzled-9 siRNA1）轉(zhuǎn)染前24小時(shí)接種HepG-2細(xì)胞于6孔板，使細(xì)胞在24小時(shí)后融合。37℃，5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，取1.5ml EP管將150mgsiRNA（20uM siRNA 3.3ul）溶于85ul 1640/DMEM，加入Hiperfect Transfection Reagent 12ul，使總體積為100ul，顛倒混勻，室溫下放置10min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。使用37℃CPBS沖洗細(xì)胞兩遍，將轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)復(fù)合物加入相應(yīng)的孔后，混勻。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。24小時(shí)后棄去含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，用37℃CPBS沖洗細(xì)胞兩遍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 trans-well轉(zhuǎn)移小室模型測(cè)定Frizzled-9對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 用70%酒精處理無菌鑷子，用鑷子裝置好小室，小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300μl預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置1小時(shí)，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液，消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，下腔室中加入500ul含有20%FBS條件培養(yǎng)基，取上述細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)，棉頭拭子擦去基質(zhì)和上方的細(xì)胞，加入500ul細(xì)胞染液（試劑盒配帶）于24孔板中，將小室放入浸泡20min，將下表面的細(xì)胞染色，將小室放入蒸餾水中洗去其它染液，空氣晾干，顯微鏡下直接觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)穿過微孔的細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Transwell侵襲小室模型測(cè)定細(xì)胞體外侵襲能力謝宏民根據(jù)前述細(xì)胞計(jì)數(shù)法，在普通顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)，見圖1。

3 討 論

（Fz）是一種細(xì)胞表面受體，它可與介導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)的Wnt配體相結(jié)合，有10個(gè)同源基因[1-2]，F(xiàn)z9在大腦和骨骼肌表現(xiàn)最為明顯，抑制其表達(dá)可引起肌肉骨骼異常和神經(jīng)系統(tǒng)問題，比如Williams綜合癥[3]。人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的Fz9表達(dá)高于正常的大腦組織細(xì)胞[4]。增加Fz9的表達(dá)可增強(qiáng)星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的致癌作用及促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

有研究表明，F(xiàn)z9表達(dá)在所有的肝癌細(xì)胞中，并且Fz9參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。而Fz9正常情況下不表達(dá)于胎兒和成人肝，通過RNAi介導(dǎo)FZ9基因沉默后，通過MTS分析可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的移動(dòng)能力下降，而通過免疫印跡方法檢測(cè)到被Fz9-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1，而后者是Wnt途徑中的關(guān)鍵因子[5]。這表明Fz9抑制細(xì)胞增殖通過細(xì)胞周期，而不是通過細(xì)胞凋亡。所以Fz9被認(rèn)為與肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)為明確證實(shí)本研究中所用的FZ9-siRNA能有效沉默F(xiàn)Z9基因。本研究從mRNA水平證實(shí)轉(zhuǎn)染si-RNA對(duì)FZ9基因表達(dá)的影響。不僅證實(shí)Fz9存在于肝癌細(xì)胞HepG-2中，并且通過RNAi介導(dǎo)的FZ9基因沉默，抑制了肝癌細(xì)胞株HepG-2的FZ9表達(dá)，通過Transwell小室模型檢測(cè)被剔除了FZ9基因HepG-2細(xì)胞移動(dòng)能力，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明FZ9基因可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與Tatsuya[6]等人的研究相似。因?yàn)镕z9-siRNA不會(huì)影響周圍正常肝組織，所以Fz9-siRNA基因沉默有應(yīng)用于臨床的可能，為肝癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，本研究證明了Fz9是肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Fz9基因可以作為一個(gè)靶基因治療原發(fā)性肝癌。

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