苜蓿除草劑生物降解的微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基配制

穆丹等

摘 要：苜蓿田長(zhǎng)殘留除草劑的大量應(yīng)用，對(duì)于后茬作物危害嚴(yán)重，進(jìn)行苜蓿田根圈土壤長(zhǎng)殘留除草劑生物降解的研究意義深遠(yuǎn)。本試驗(yàn)對(duì)肇東苜蓿田根圈除草劑生物降解過(guò)程中微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組分和配制方法進(jìn)行研究，以期為開(kāi)展苜蓿田長(zhǎng)殘留除草劑生物降解菌活性成分的提取及應(yīng)用提供可靠的技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：除草劑；生物降解；微生物；計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

中圖分類號(hào) S476+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）08-13-02

苜蓿以“牧草之王”著稱，不僅產(chǎn)量高，且草質(zhì)優(yōu)良。肇東苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhaodong）為苜蓿屬的優(yōu)良牧草，是20世紀(jì)30年代由外地引種到黑龍江省肇東縣軍馬場(chǎng)的紫花苜蓿，在當(dāng)?shù)卦耘喽嗄辏蠖麨檎貣|苜蓿，迄今已有80多年的栽培歷史[1]。肇東苜蓿植株多為直立，花紫色，顏色有深有淺，葉片大小與葉形不整齊[2]。該品種抗寒性強(qiáng)，無(wú)雪或少雪的半干旱地區(qū)，在-33℃的低溫下仍可露地越冬。在有雪覆蓋的大小興安嶺嚴(yán)寒地區(qū)，-45℃尚可安全越冬。其豐產(chǎn)性能好，干草產(chǎn)量6.75～10.5t/hm2；適應(yīng)區(qū)域廣，宜植區(qū)為東北北部、內(nèi)蒙古東部、新疆、甘肅等地[3]。

由于苜蓿田種植面積的不斷擴(kuò)大和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的加快，為提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，有效防治病、蟲(chóng)、草害，越來(lái)越多的長(zhǎng)殘留除草劑應(yīng)用于苜蓿田。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑的使用面積迅速擴(kuò)大[4]。至20世紀(jì)90年代末期，黑龍江省長(zhǎng)殘留除草劑年銷售量（制劑）為：氯嘧磺隆60～70t，咪唑乙煙酸800～1000t，異噁草酮200～300t，氯磺隆20～30t，阿特拉津600～700t[5-6]。長(zhǎng)殘留除草劑以前所未有的速度進(jìn)一步發(fā)展， 特別是氯嘧磺隆與咪唑乙煙酸已成為苜蓿田難以取代的化學(xué)藥劑。這種現(xiàn)象將導(dǎo)致后茬敏感作物受害頻繁發(fā)生，造成苜蓿田減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。面對(duì)此種局面，對(duì)于苜蓿田根圈土壤長(zhǎng)殘留除草劑生物降解的研究勢(shì)在必行且意義重大。本試驗(yàn)擬對(duì)肇東苜蓿田根圈除草劑生物降解過(guò)程的微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組分和配制方法進(jìn)行研究，以期為開(kāi)展苜蓿田長(zhǎng)殘留除草劑生物降解菌活性成分的提取及應(yīng)用提供可靠的技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)的材料如下：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖、蒸餾水、淀粉、KH2PO4、MgSO4、KNO3、FeSO4、KNO3、FeSO4·7H2O、K2HPO4等。

1.2 設(shè)備 HS-1300-U型水平循環(huán)潔凈凈化工作臺(tái)（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）、HZQ-C型雙層恒溫?fù)u床（金壇市順華儀器有限公司）、干燥箱、電磁爐、高壓滅菌鍋、分析天平、722型分光光度計(jì)、pH計(jì)等。

2 土壤微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組成與配制方法

2.1 除草劑生物降解中的真菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

2.1.1 真菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組成 馬丁氏培養(yǎng)基是一種用來(lái)分離真菌的選擇性培養(yǎng)基，由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉紅（玫瑰紅，Rose Bengal）及鏈霉素等組成，具體成分見(jiàn)表1。

2.1.2 真菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制方法 （1）稱量和溶化：按照培養(yǎng)基的配方，準(zhǔn)確稱取KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、蛋白胨，并將各成分依次溶于少許蒸餾水中。將孟加拉紅配成1%的溶液，量取1%孟加拉紅溶液3.3mL，加入培養(yǎng)液中，混勻后，加入16g瓊脂，加熱溶化。待各成分完全溶化后，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL。（2）將配制好的溶液分裝、加塞、包扎、高壓滅菌。滅菌冷卻后，4℃保存?zhèn)溆谩＃?）抗生素的配制：將鏈霉素配制成1%的溶液，濃度為100ug/mL。由于抗生素（鏈霉素）受熱容易分解，故臨用時(shí)，將培養(yǎng)基溶化后待溫度降至約45℃時(shí)才可加入。

2.2 除草劑生物降解中的細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

2.2.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組成 牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基是用來(lái)分離細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基，也是一種應(yīng)用十分廣泛的天然培養(yǎng)基，由牛肉膏、蛋白胨及NaCl等成分組成，具體成分見(jiàn)表2。其中，牛肉膏可為微生物提供碳源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，NaCl可為微生物提供無(wú)機(jī)鹽。

2.2.2 細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制方法 （1）稱量和溶化：按照培養(yǎng)基的配方，準(zhǔn)確稱取牛肉膏、蛋白胨和NaCl，并將各成分依次加入少許蒸餾水中，用玻璃棒攪勻，將燒杯置于火上加熱。待各組分溶解后，加入瓊脂2g，不斷攪拌，以免粘底。瓊脂完全溶解后，補(bǔ)足蒸餾水至100mL。（2）調(diào)pH值：先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)液的pH值，如pH值偏酸，則用滴管向培養(yǎng)液中逐滴加入1mol/L的NaOH，邊加邊攪拌，直至pH值達(dá)7.0～7.2。如pH值偏堿性，則用1mol/L的HCl。注意pH值不應(yīng)調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)，否則將影響培養(yǎng)液中各離子的濃度。（3）將配制好的溶液分裝、加塞、包扎，121℃、1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20min。滅菌冷卻后，置于37℃溫室中培養(yǎng)24～48h，檢查滅菌是否徹底。

2.3 除草劑生物降解中的放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

2.3.1 放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組成 放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，是用來(lái)培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。如果加入適量的抗菌藥物，則可用來(lái)分離各種放線菌。其主要成分包括KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、瓊脂、可溶性淀粉以及蒸餾水等，具體成分見(jiàn)表3。

2.3.2 放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制方法 （1）稱量和溶化：按照培養(yǎng)基的配方，先稱取可溶性淀粉2g，將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少許沸水，置于火上加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后，準(zhǔn)確稱取KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、瓊脂以及FeSO4·7H2O（微量成分FeSO4·7H2O可先配成高濃度的貯備液，按比例換算后加入）。待各組分完全溶解后，補(bǔ)足蒸餾水至100mL。（2）調(diào)PH值：先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)液的pH值，如PH值偏酸，則用滴管向培養(yǎng)液中逐滴加入1mol/L的NaOH，邊加邊攪拌，直至pH值達(dá)7.2～7.4。如pH值偏堿性，則用1mol/L的HCl。注意pH值不應(yīng)調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)，否則將影響培養(yǎng)液中各離子的濃度。（3）將配制好的溶液分裝、加塞、包扎，121℃、1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌20min。滅菌冷卻后，置于37℃溫室中培養(yǎng)24～48h，檢查滅菌是否徹底。

此合成培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有多種化學(xué)成分已知的無(wú)機(jī)鹽，這些無(wú)機(jī)鹽可能相互作用產(chǎn)生沉淀。因此，混合培養(yǎng)基成分時(shí)，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時(shí)還需要將兩種或多種成分分別滅菌，使用時(shí)再按比例混合。

3 結(jié)果與討論

試驗(yàn)對(duì)于肇東苜蓿田根圈土壤微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制進(jìn)行了探討，包括真菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基以及放線菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的組分和具體的配制方法研究。通過(guò)本試驗(yàn)的研究，為長(zhǎng)殘留除草劑生物降解中土壤微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的配制提供了可靠的組分和技術(shù)方法。同時(shí)，肇東苜蓿田除草劑生物降解中土壤微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基配制的研究成果擬在生產(chǎn)上進(jìn)行應(yīng)用，將具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和深遠(yuǎn)的意義，也將為開(kāi)展苜蓿田長(zhǎng)殘留除草劑生物降解菌活性成分的提取及應(yīng)用提供可靠的技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。

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