石蠟切片制作方法的改良

毛曉霞

摘 要：創(chuàng)立了一種時間短、質(zhì)量高的石蠟切片制作方法。針對動植物材料結(jié)構(gòu)特點不同，在脫水、透明、透蠟、包埋、染色和封固等環(huán)節(jié)進行了一系列改良，獲得了染色清晰、組織結(jié)構(gòu)完整的切片。該文以小蠟樹為例，詳細介紹了改良后的石蠟切片制作方法。實驗結(jié)果表明，相比傳統(tǒng)制作方法，改良后的制作方法減少了切片制作時間，縮短了實驗周期。同時，有效地提高了批量制備石蠟切片標(biāo)本的整體質(zhì)量，有利于實驗教學(xué)和組織學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域的研究工作。

關(guān)鍵詞：組織學(xué)；石蠟切片；制作方法：改良

中圖分類號 Q-34 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）08-15-02

石蠟切片制作技術(shù)近年來廣泛應(yīng)用于組織學(xué)、細胞生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)和病理學(xué)等領(lǐng)域。細胞和組織多為無色透明，離開機體后會很快發(fā)生溶解和腐敗，細胞原始形態(tài)和結(jié)構(gòu)難以保存[1]。通過石蠟切片制作技術(shù)，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色及封固等步驟，可以清晰辨認其形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加樣品不同細胞成分之間的對比度。但缺點是石蠟切片制作過程復(fù)雜，制作周期長，組織塊易破碎，切片皺褶多等[2]。筆者通過長期的摸索，改進了常規(guī)石蠟切片制作方法，縮短了時間，并將重點步驟加以改良，以利于短時間制作出高質(zhì)量的切片。本文以小蠟樹為例，將改良后的石蠟切片制作方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 小蠟樹葉片采自安慶師范學(xué)院植物園。試驗儀器：石蠟切片機Leica RM2235、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、光學(xué)顯微鏡。試驗試劑：無水乙醇、95%乙醇、丙酮、二甲苯、石蠟為上海標(biāo)本模型廠生產(chǎn)，熔點56～58℃，中性樹膠為上海生工產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 取材與固定 摘取幼嫩的小蠟樹葉片，拿雙面刀片，過葉片主脈做橫切面，切成1cm×1cm大小，取材后立即投入carnoy固定液中固定。4℃保存，固定7d，可以延長固定時間，但最長不超過兩周[3]。取材要準(zhǔn)確、迅速和新鮮，防止細胞組織發(fā)生自溶現(xiàn)象[4]。固定液的體積應(yīng)為材料總體積的10～15倍。除了carnoy固定液外，根據(jù)實驗材料性質(zhì)不同，選取不同的固定液。例如動物使用20%福爾馬林，原位雜交使用4%的多聚甲醛，也可將多種固定液混合使用。

1.2.2 脫水與透明 將固定后的材料用鑷子夾出，投入不同濃度梯度的乙醇中脫水，乙醇要放在有蓋容器中[5]。依次為：50%乙醇、6h—>75%乙醇、6h—>85%乙醇、3h—>95%乙醇、1h，95%乙醇、0.5h—>無水乙醇Ⅰ、10min—>無水乙醇Ⅱ、10min—>丙酮0.5h。

樣品材料完成脫水后，還需用透明劑替代脫水劑，增加樣品的折光率，該過程也需要在濃度梯度下進行以達到更好的透明效果。將樣品放入有蓋容器內(nèi)，將無水乙醇與二甲苯等比例混合，透明0.5h，再放入二甲苯Ⅰ、5min，二甲苯Ⅱ、5min。時間不宜過長，以免使組織變硬發(fā)脆，切片時容易出現(xiàn)裂痕。

1.2.3 浸蠟與包埋 將樣品放入融化的固體石蠟中慢慢浸透，2～4個h效果最好，時間過長會造成組織脆變[6]。浸蠟完成后，將油紙折疊成紙船，油面向內(nèi)，保證內(nèi)面的干凈和平滑，將融化好的石蠟倒入紙船，石蠟觸手溫?zé)幔瑴囟炔荒芨哂?0℃。將組織材料放入，并用鑷子擺好橫切面位置，一個包埋塊內(nèi)根據(jù)材料大小放入5～7片樣品。包埋時動作要迅速，防止石蠟塊凝結(jié)。

1.2.4 切片、貼片 將包埋塊放6℃冰箱中過夜，便于切片。將做好的包埋塊底部用酒精燈加熱，待底部石蠟融化后焊在小木塊上。用酒精燈加熱鑷子，用鑷子將包埋塊和木塊焊接牢固。修整包埋塊，讓樣品露出，包埋塊上下兩邊平行。調(diào)整切片機刀刃與蠟塊表面成5°夾角，刀片從最左側(cè)開始使用，以延長刀片使用壽命。必須使用鋒利的刀片，否則蠟帶易卷曲有波紋[7]。將切好的蠟帶放入40℃蒸餾水中展片，在載玻片上滴一滴明膠粘片劑，手指涂勻，用載玻片撈出切片，調(diào)整蠟帶，使其處于玻片的中心位置，也可用鑷子將蠟帶的皺褶展平。將貼好的切片于溫箱中烤干，溫度不超過60℃、0.5h，溫度過高或者時間過長會造成切片產(chǎn)生氣泡或者脫片。

1.2.5 染色 切片烤干后，經(jīng)二甲苯脫蠟8min，逐級乙醇復(fù)水，每級5min，然后進行染色[8]。先用1%番紅水溶液染色2h，再用1%固綠染色5min。染色時間根據(jù)環(huán)境溫度和染料配置時間略作調(diào)整。環(huán)境溫度低，染料不是新鮮配置的，可適當(dāng)增加染色時間。若環(huán)境溫度過低，可放入烘箱中加熱。

1.2.6 脫水、透明、封片 染色完成后，濃度梯度乙醇每級脫水10min，最后一步無水乙醇脫水0.5h，再用二甲苯透明8min，用中性樹膠封片。

2 結(jié)果與分析

制成的小蠟樹石蠟切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞核清晰可見，染色質(zhì)均勻，細胞核和染色質(zhì)色彩鮮艷，對比明顯，切片厚度均勻，切片制作觀察結(jié)果理想。在切片制作過程中，要注意兩點：

2.1 材料的脫水要徹底 在脫水過程中，常見的問題是脫水不徹底和硬化。若樣品組織有殘留水分，二甲苯和液體石蠟將無法滲入組織，給透明和浸蠟帶來不便。脫水不徹底，會造成切片呈現(xiàn)云霧狀，此時要重新進行脫水步驟。為使組織與支持劑混合，有利于組織的透明和浸蠟，必須把組織中的水分徹底脫除[9]。

首先，選擇合適的乙醇濃度梯度，不能首先放在較高濃度的乙醇中，防止組織驟然失水，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)變形。如果是含水分較多的物質(zhì)，最好用40%的乙醇開始脫水，濃度梯度至少要包括5級，最后無水乙醇要重復(fù)2次。盛放樣品的容器在裝溶劑前也要晾干水分，以免降低試劑濃度。

其次，要選擇合適的脫水時間。時間的長短根據(jù)實驗材料的性質(zhì)、大小和厚度等來確定。柔軟或者輕薄的材料，比如小鼠腦組織，脫水時間不宜太長，否則造成組織過度硬化和變脆，切片時會碎裂。樣品較厚、組織堅硬的材料適當(dāng)延長脫水時間[10]。組織塊在高濃度乙醇中，尤其是無水乙醇中，不能放置太長時間。無水乙醇有很強的吸水能力，組織塊迅速大量失水，導(dǎo)致過度硬化，給切片帶來困難。如果脫水的過程中需要過夜，可以將組織塊停放在70%的酒精中保存。

第三，保證穩(wěn)定的試劑濃度。不僅是脫水、固定、透明、脫蠟、復(fù)水、染色等步驟都需要準(zhǔn)確的試劑濃度，而且在實驗進行的過程中都要保持試劑濃度的穩(wěn)定，以達到最好的實驗結(jié)果。所以，需在有蓋容器中進行，防止乙醇蒸發(fā)，也可以更換新液。更換試劑時，動作要迅速，避免試劑和樣品組織吸收空氣中的水分[11]。

最后，清除切片上試劑殘留，減少試劑間的相互干擾。將組織塊從低濃度溶液中拿出后，要放在吸水紙上吸干水分，防止把低濃度試劑帶入高濃度試劑中，影響最終的切片質(zhì)量。

2.2 注意石蠟的選擇與制備 首先，根據(jù)組織的密度、切片厚度和氣候選擇不同種類的石蠟。天熱的時候（30℃以上）或者細胞壁堅韌的組織用高熔點石蠟，天冷的時候（30℃以下）或者較軟組織，用低熔點石蠟。或者先用低熔點石蠟浸透，再放入硬度高的高熔點石蠟中浸透[12]。浸蠟是用石蠟置換組織中的透明劑，為包埋提供固相支持。包埋進一步強化了組織的硬度，使組織和包埋劑處于同一硬度，便于切片和粘連。所以，浸蠟和包埋所選用的石蠟要一致，以保證切片時能夠切出完整蠟片。

第二，石蠟的制備。良好的石蠟塊應(yīng)是半透明狀態(tài)，潔凈，不含有水分、雜質(zhì)、結(jié)晶或者顆粒等其他異物，觸手滑而不膩。新石蠟在使用之前，需要反復(fù)加熱沸騰，用紗布過濾，除去氣泡和雜質(zhì)。如果石蠟過硬，可以融化后加入蜂蠟、松香等，以降低硬度，增加其柔韌性，便于切出平滑和完整的切片。舊石蠟制樣效果好，盡量選用舊石蠟。也可以將新舊石蠟混合融化，新石蠟的量不超過1/3。

第三，在進行浸蠟和包埋前，樣品組織表面沾有透明劑二甲苯，如果二甲苯揮發(fā)不完全，會造成組織塊變軟，組織表面凹陷。所以，要風(fēng)干樣品組織表面的二甲苯，防止二甲苯帶入石蠟。石蠟在長時間的使用過程中會落入灰塵和雜質(zhì)，因此需要多次融化過濾，保證石蠟質(zhì)量。

最后，如果包埋后的蠟塊有白色混濁狀，可能是由于脫水不徹底、二甲苯揮發(fā)不完全、石蠟不純、質(zhì)地不均等造成，需要找出原因，重新制作[13]。一個好的包埋塊應(yīng)該是半透明、質(zhì)地均勻和無顆粒的狀態(tài)。

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