深黃被孢霉突變株A35—4產多不飽和脂肪酸發酵條件優化

劉尚杰 巴敏 許本波 田志宏 謝伶俐

摘要：以深黃被孢霉（Mortierella isabellina）突變株A35-4為材料，通過單因素試驗及正交試驗探討了發酵條件對A35-4產多不飽和脂肪酸的影響。結果表明，突變株A35-4的最佳發酵培養基配方為60 g/L果糖、3 g/L牛肉膏、3 g/L磷酸二氫鉀、0.6 g/L MgSO4、2.0 g/L檸檬酸鈉、1.0 g/L菜子油，初始pH 6.0，先28 ℃培養4 d，然后20 ℃培養3 d。

關鍵詞：深黃被孢霉（Mortierella isabellina）；多不飽和脂肪酸；優化；發酵

中圖分類號：Q815 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1920-04

多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）及其衍生物在大腦發育、過敏反應及心血管運動等一系列生理功能中發揮重要作用，具有維護生物膜的結構和功能、治療心血管疾病、抗炎、抗癌、促進大腦發育、減肥以及增加動物的產仔率和成活率等生理功能[1-7]。隨著人類生活水平的提高，運動量的減少，PUFAs對人類的健康就顯得越來越重要。長期以來人們都是從動植物油脂中提取PUFAs，但動植物的生長受到季節、地理位置等的影響而使PUFAs含量變動較大，提取成本高，周期長，不能適應市場的需要，且動植物油脂資源含油量及不飽和脂肪酸類型、比例均受到一定的限制。因此，近年來人們一直在探索利用誘變育種等技術，對現有產PUFAs菌株進行改造，進一步提高PUFAs的含量。開發微生物 PUFAs 可以部分或完全取代動物、植物中的 PUFAs，有著廣闊的市場前景[8，9]。

袁成凌等[6]采用不同誘變方法對高山被孢霉（Mortierella alpina）進行誘變育種，獲得多株花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA）高產菌株，ARA 產量最高達到7.43 g/L，王嘯等[10]對深黃被孢霉（As3.2793）進行復合誘變獲得突變株MUI0310，ARA 產量為 0.73 g/L。目前產 PUFAs 的出發菌株多為被孢霉屬真菌，但由于野生菌株產PUFAs的能力很低，因此急需利用誘變育種等方法培育出高產菌株[11，12]。

在前期研究中，以深黃被孢霉As3.3410為出發菌株，利用微波誘變和紫外誘變，乙酰水楊酸與低溫（15 ℃）相結合的篩選方法，獲得1株高產多不飽和脂肪酸菌株A35-4[13]，其生物量為17.9 g/L，油脂含量為67.8%，油脂產量為12.12 g/L，PUFAs含量為20.3%，PUFAs產量為2.46 g/L，連續斜面傳代培養證實該菌株具有較好的遺傳穩定性。本研究探討了深黃被孢霉突變株A35-4的發酵條件，對其培養基組成和培養條件進行了優化，得到深黃被孢霉突變株A35-4發酵的最佳培養基組成和合適的產脂條件，為工業化生產打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 深黃被孢霉突變株 A35-4由購自中國科學院微生物研究所的深黃被孢霉As3.3410誘變篩選得到。

1.1.2 培養基 斜面培養基為 PDA 培養基（土豆瓊脂培養基）：200.0 g/L馬鈴薯，20.0 g/L葡萄糖，20.0 g/L瓊脂，于1×105Pa滅菌20 min。種子培養基：100.0 g/L葡萄糖，1.0 g/L磷酸二氫鉀，0.3 g/L硫酸鎂，2.0 g/L酵母膏，2.0 g/L硫酸銨，pH 6.1，于1×105 Pa滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 搖瓶種子培養：取活化7 d的PDA菌種斜面，用5 mL無菌水洗下孢子，倒入裝有50 mL搖瓶種子培養基的150 mL三角瓶中，于28 ℃以180 r/min振蕩培養48 h。搖瓶產脂培養：取培養48 h的搖瓶種子培養液2 mL接入裝有 100 mL產脂培養基的 250 mL三角瓶中，于28 ℃以180 r/min振蕩培養7 d。

1.2.2 分析方法 油脂含量定量分析：索氏抽提法[14]。氣相色譜分析： PUFAs含量的氣相色譜測定委托中國農業科學院油料作物研究所測試中心完成。

1.2.3 單因素試驗 ①溫度對突變株發酵的影響。在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）條件下探討發酵溫度對突變株生產和產脂的影響。菌株固定接種量為2%，以180 r/min振蕩培養7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。②碳源對突變株發酵的影響。在基本產脂培養基中分別添加濃度均為100 g/L的葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖和乳糖，配制成含不同碳源的產脂培養基。菌株固定接種量為2%、以180 r/min振蕩培養7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。③氮源對突變株發酵的影響。在基本產脂培養基中分別添加濃度均為3 g/L的酵母膏、硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏、蛋白胨和尿素，配制成含不同氮源的產脂培養基。菌株固定接種量為2%，以180 r/min振蕩培養7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。④金屬離子對突變株發酵的影響。在基本產脂培養基中分別添加濃度均為0.5 g/L的Na2SO4、FeSO4、MgSO4、ZnSO4和Ti（SO4）2，配制含不同金屬離子的產脂培養基。菌株固定接種量為2%，以180 r/min振蕩培養7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。⑤添加植物油對突變株發酵的影響。在基本產脂培養基中添加體積分數均為0.1%的橄欖油、大豆油、芝麻油、花生油和菜子油，配制成含植物油的產脂培養基。菌株固定接種量為2%，以180 r/min振蕩培養7 d后收集菌體并測量生物量和油脂含量。

1.2.4 正交試驗 以基本產脂培養基+2.0 g/L檸檬酸鈉+1.0 g/L菜子油為基本培養基，添加不同濃度的果糖、牛肉膏、磷酸二氫鉀和MgSO4，初始pH 6.0，菌株接種量為2%，先于28 ℃培養4 d，然后于20 ℃培養3 d，接下來收集菌體并測量PUFAs含量，計算PUFAs產量。采用四因素三水平的正交試驗L9（34）優化深黃被孢霉突變株的產脂培養基配方。試驗的因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 溫度對突變株發酵的影響

由圖1可知，菌絲生長和油脂合成的最適溫度不一致，在10 ℃時由于溫度過低，突變株菌絲幾乎停止生長，25～30 ℃的溫度適合于菌絲生長，菌絲大量繁殖。15～20 ℃適合于油脂積累，因此在試驗中采取先在28 ℃使其菌絲增殖，再降低培養溫度至20 ℃，使其積累油脂。

2.2 碳源對突變株發酵的影響

由表2可知，以果糖為碳源時，生物量和油脂含量均較大，說明果糖是突變株A35-4合成油脂的較好碳源。

2.3 氮源對突變株發酵的影響

由表3可知，酵母膏和牛肉膏較適合菌體生長，蛋白胨和牛肉膏較有利于油脂合成，綜合考慮各氮源對油脂產量的影響，確定牛肉膏為A35-4生長和產油脂的合適氮源。

2.4 金屬離子對突變株發酵的影響

由表4可知，添加FeSO4時油脂產量最高，但各處理間油脂產量沒有顯著差異。

2.5 添加植物油對突變株發酵的影響

Shinmen等[15]研究發現，在培養基中添加植物油對微生物積累油脂有促進作用。由表5可知，在基礎產脂培養基中分別添加花生油、菜子油、大豆油、芝麻油和橄欖油，都能不同程度地促進菌絲體的生長及菌絲體中油脂的積累，其中菜子油效果最好，生物量提高了30.31%，油脂含量提高了16.04%，這可能是因為植物油中都含有豐富的油酸和亞油酸，這些脂肪酸既可作為碳源又可作為合成PUFAs等的前體物被利用。

2.6 果糖、牛肉膏、MgSO4、磷酸二氫鉀濃度對發酵產PUFAs的影響

由表6可知，基本產脂培養基中添加果糖、牛肉膏、磷酸二氫鉀、MgSO4的最佳組合為A1B2C3D3，即60 g/L果糖、3 g/L牛肉膏、3 g/L磷酸二氫鉀和0.6 g/L MgSO4。在基本培養基+60 g/L果糖+3 g/L牛肉膏+3 g/L磷酸二氫鉀+0.6 g/L MgSO4+2.0 g/L檸檬酸鈉+1.0 g/L菜子油，初始pH 6.0，先28 ℃培養4 d，然后20 ℃培養3 d的條件下進行驗證試驗，得到PUFAs的最高產量達到3.6 g/L。

3 小結與討論

自1988年Shimizu等[16]報道高山被孢霉是進行γ-亞麻酸（GLA）商業化生產的潛在資源以來，國內外對產GLA的微生物進行了大量研究。為提高GLA含量，研究人員主要通過物理或化學手段改變菌株遺傳物質，然后進行培養條件的優化。1996年Hiruta等[17]以拉曼被孢霉為出發菌株，經過亞硝基胍誘變，采用抗低溫篩選方法，獲得一株突變株，經過培養條件優化后其GLA含量高達18.3%。陳波等[18]以深黃被孢霉為出發菌株，經紫外線誘變，用抗脂肪酸脫氫酶抑制劑抑芽丹的篩選方法，獲得深黃被孢霉突變株，其GLA含量是出發菌株的1.07倍。李忠玲等[19]以少根根霉為出發菌株，利用紫外線誘變結合失水蘋果酰肼篩選的方法，選育出突變株，搖瓶培養后菌體油脂含量為35.55%，其中GLA占油脂的12.5%，比原始菌株油脂含量提高了93.94%，GLA含量提高了276.5%。李麗娜等[20]采用微波誘變并結合乙酰水楊酸對深黃被孢霉進行篩選，獲得一株高產菌株，其生物量為30.85 g/L，總油脂含量為15.5 g/L，花生四烯酸（ARA）濃度為2.61 g/L，ARA產量比原始對照菌株提高3.18倍，并且遺傳性能穩定。

在前期試驗中，通過誘變結合低溫篩選的方法，得到高產菌株A35-4，但其生物量低[13]。本研究通過單因素試驗及正交試驗，對突變株A35-4發酵生產PUFAs的發酵條件進行了優化，確定突變株A35-4最佳產脂培養基組成和發酵條件為：60 g/L果糖、3 g/L牛肉膏、3 g/L磷酸二氫鉀、0.6 g/L MgSO4、2.0 g/L檸檬酸鈉、1.0 g/L菜子油，初始pH 6.0，先28 ℃培養4 d，然后20 ℃培養3 d。

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