HPLC法測定四季三黃片中大黃素、大黃酚的含量

武曉紅?敬永升?劉曉軍

[摘要] 目的 采用高效液相法測定四季三黃片中大黃素、大黃酚的含量。 方法 用高效液相色譜檢測法，Elite C18色譜柱，流動相為甲醇∶水（87∶13，pH=4.5），流速為 1.000 mL/min，檢測波長254nm，柱溫：室溫。 結果 大黃素和大黃酚分別在10.1～50.5μg/mL和9.97～99.7μg/mL范圍內線性關系良好，平均回收率分別為100.8%和100.2%。 結論 該方法簡便、靈敏、可靠、準確、重現性好。

[關鍵詞] 四季三黃片；大黃素；大黃酚；含量測定

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）06-96-03

四季三黃片由大黃、黃芩、梔子、黃柏四味藥組成。該藥消炎退熱，通便利水，用于口鼻生瘡，咽疼齒痛，口干舌燥，目眩頭暈，大便秘結，小便赤黃[1]，具有消炎退熱、通便利水的功效[2]，臨床上主要用于口舌生瘡、咽喉腫痛、頭暈目眩等癥[3]。其主要成分大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim. Ex Balf）或藥用大黃（Rheum officinale Bail）的干燥根及根莖。具有瀉熱通便、解毒消癰、行瘀通經、清熱除濕之功效。臨床用于胃腸實熱積滯、大便秘結、腹部脹滿、熱毒瘡瘍、暴赤眼痛、口舌生瘡、齒齦腫痛、濕熱壅滯之黃疸、小便不利、大便干結等[4]。其中大黃素和大黃酚是大黃的主要有效成分[5]。目前測定大黃素和大黃酚含量的方法多為HPLC法，也有薄層掃描法。本研究采用HPLC法對四季三黃片中大黃的主要有效成分大黃素和大黃酚進行含量測定[6]。結果表明，使用該法測定時，其線性關系好、準確度高、穩定性好、專屬性強、重復性好，可用于大黃素和大黃酚的質量控制方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC–10AT型高效液相色譜泵（日本島津）；SPD–10A型紫外檢測器（日本島津）；N–2000雙通道色譜工作站（浙江大學智達信息有限公司）；色譜柱Hypersil–ODS（4.6 mm×150 mm，5 ?m，大連依利特科學儀器有限公司）；AG135型電子天平（瑞士，梅特勒-托利多）；HS10260D型超聲波清洗機（天津市恒奧科技發展有限公司）等。

1.2 試劑

大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110756-200110）；大黃酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110796-200716）；四季三黃片（江西華太藥業有限公司，批號：091039）；甲醇（一級色譜純，天津四友生物醫學技術有限公司）；純凈水（樂百氏有限公司）；冰醋酸（分析純，萊陽化工實驗廠）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件選擇

色譜柱：Hypersil-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5?m）購自大連依利特公司，流動相：甲醇-水（87∶13），用醋酸調pH=4.50，流速：1.000 mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫：室溫，進樣量：20?L。在此色譜條件下，得到大黃素、大黃酚對照品混合溶液的HPLC圖譜（圖1）及供試品溶液的HPLC圖譜（圖2）。

1.大黃素峰；2.大黃酚峰

1.大黃素；2 .大黃酚

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取大黃素對照品，大黃酚對照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，超聲20 min，既得濃度為101.00μg/mL的大黃素對照品溶液和濃度為99.70μg/mL的大黃酚對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品的制備 取供試品10片，精密稱量，去包衣，研細，精密稱取0.9953 g于25 mL容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，加甲醇至刻度，靜置，濾過，取濾液搖勻既得供試品溶液，備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取2.2.1項下的大黃素對照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每毫升含大黃素10.1、20.2、30.3、40.4、50.5μg的大黃素標準溶液，另精密吸取2.2.1項下的大黃酚對照品溶液1.00、3.00、5.00、7.00、10.00 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每毫升含大黃酚9.97、29.9、49.9、69.8、99.7μg的大黃酚標準溶液。各取20 ?L注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖。每種濃度進樣三次，取其3次峰面積平均值，結果見表1～2。以大黃素、大黃酚濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算出回歸方程：大黃素Y=33 232X+233.72（r=0.9999）；大黃酚Y=41 442X+160 000（r=0.9997）。結果表明大黃素在10.1～50.5μg/mL范圍內具有良好線性關系；大黃酚在9.97～99.7μg/mL范圍內具有良好線性關系。

2.3.2 精密度實驗 取線性關系項下的大黃素對照品溶液（50.5μg/mL）20 ?L，重復進樣6次，依法測定，記錄色譜圖，平均峰面積為1675 125.333，RSD=0.91%（n=6）。取線性關系項下的大黃酚對照品溶液（49.9μg/mL）20 ?L，重復進樣6次，依法測定，記錄色譜圖。平均峰面積為2 182 387.833，RSD=0.84%（n=6）。

2.3.3 穩定性實驗 按2.2.2項下供試品制備方法制備1份樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進行測定，按上述色譜條件進行HPLC分析，記錄色譜圖。大黃素和大黃酚的RSD分別為1.26%和0.67%。結果表明供試品溶液穩定性良好。

2.3.4 重復性實驗 同一批樣品6份取，按2.4含量測定項下方法配制樣品溶液，取每份溶液20 ?L進樣，記錄色譜圖，測定大黃素和大黃酚峰面積，計算大黃素RSD為0.83%，大黃酚RSD為0.91%。見表6。結果表明，該法重復性良好。

2.3.5 回收率實驗 精密稱取含量測定項下已知含量（大黃素0.2355 mg/片、大黃酚0.4007 mg/片）的供試品儲備液（批號：091039）5.00 mL于10 mL容量瓶中，在此容量瓶中精密加入大黃素對照品儲備液1.50 mL，大黃酚對照品儲備液2.50 mL，用流動相稀釋至刻度，搖勻，超聲20 min，用0.45 ?m的濾膜過濾即得。進樣6次，每次進20 ?L，記錄色譜圖，計算回收率。測得大黃素的回收率為100.8%，結果見表1；大黃酚的回收率為100.2%，結果見表2。

2.4 樣品測定

按2.2.2項下供試品溶液的配制方法制備6份（3批）四季三黃片供試品溶液，分別用0.45 ?m濾膜濾過，取續濾液，按2.1項下色譜條件每份進樣3次， 每次進樣20?L，記錄色譜圖，測定峰面積，由峰面積根據回歸方程計算大黃素、大黃酚的含量。結果見表3、4。

3 結論

市場三黃片的銷售量很大，很多廠家生產的三黃片未按處方投料等存在質量問題，為了保證臨床用藥和個人用藥的安全性和有效性。制備工藝的規范也非常重要，本實驗采用HPLC法對四季三黃片中大黃素、大黃酚的含量進行測定。四季三黃片中大黃素、大黃酚的含量是主要質量標準，這項工作科學的評價該藥品的質量，具有重要意義。實驗表明其線性關系良好，穩定性及重復性均較好，精密度好、準確度高，可作為該產品含量測定的可靠方法。

[參考文獻]

[1] 馮源，張德全，周濃，等.HPLC測定四季三黃片中5種蒽醌類衍生物的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（7）：96-99.

[2] 馮看，楊黎.HPLC測定四季三黃片中大黃素和大黃酚的含量[J].廣西中醫學院學報，2008，11（2）：50-52.

[3] 郭洛宏.HPLC法測定三黃片中鹽酸小檗堿、大黃素和大黃酚含量的結果分析[J].中國藥房，2011，22（40）：3824-3826.

[4] 王潔，張嬙，張一鳴，等.超聲提取合HPLC測定三黃片中大黃素和大黃酚的含量[J].遼寧中醫藥大學學報，2010，12（11）：62-64.

[5] 王潔，張一鳴，李進冉，等.市售三黃片中大黃素和大黃酚的含量測定及相關分析[J].河北理工大學學報2009，31（2）：93-99.

[6] 祝忠民，盧曉榮.HPLC法同時測定三黃片中4種成分的含量[J].西北藥學雜志2008，23（5）：300-301.

（收稿日期：2013-01-21）