熒光定量PCR檢測HBV—DNA與ELISA法乙肝免疫學檢測的探討

黃靜

[摘要] 目的 探討熒光定量PCR法檢測HBV-DNA與ELISA法乙肝免疫學指標的相關性。 方法 采用ELISA 法和熒光定量PCR技術分別對353 例乙型肝炎患者血清進行免疫學指標的檢測及HBV-DNA 的定量檢測。 結果 ELISA法呈大三陽組患者的HBV-DNA陽性率及病毒平均拷貝數均高于小三陽組；HBeAg（+）組的陽性率及病毒平均拷貝數高于HBeAg（-）組；HBeAb（+）組有較低的HBV-DNA陽性率及病毒平均拷貝數。 結論 HBV-DNA 的含量與乙肝免疫學檢測結果具有相關性。臨床上應注意兩者聯合應用。

[關鍵詞] HBV-DNA；ELISA法；乙肝；免疫標志物

[中圖分類號] R512.62 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）06-110-03

乙型肝炎是目前最常見的威脅人類健康的傳染病之一。我國是乙型肝炎的高發區，并且近年來其發病率有上升趨勢[1]。因此做好乙肝的檢測對于傳染病的防控及臨床診治有重要的意義。目前臨床最常用的乙肝篩查及診斷治療的方法是檢測乙肝免疫學指標，即乙肝五項指標。而在免疫指標檢測方面最常用的是酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法，它反映人體對HBV的免疫反應狀態，具有快速、價廉、簡便的特點，適合乙肝的大批量篩查及快速診斷；但是不能直接反映HBV在患者體內的復制情況。而熒光定量PCR檢測HBV-DNA法可直接監測血清中乙肝病毒核酸的載量，是判斷病毒復制活躍程度及是否具有傳染性的可靠依據，對臨床抗病毒治療及判斷預后均具有指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年6月～2012年6月在本院門診、住院及健康查體的HBsAg（+）標本共353例，其中女157例，男196例。按患者的乙肝病毒血清免疫學標志物組合分為6組：A組（大三陽）HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+），共112例；B組（小三陽）HBsAg（+）、HBeAb（+）、HBcAb（+），共93例；C組 HBsAg（+）、HBeAg（+），共45例；D組 HBsAg（+）、HBeAg（-），共31例；E組 HBsAg（+）、HBeAb（+），共53例。

1.2 研究方法

1.2.1 HBV免疫學檢測 采用用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法。試劑由上海科華生物工程公司生產，使用BIO-RAD Model 680酶標儀比色來判斷結果。操作過程及結果判讀按試劑說明書進行。

1.2.2 HBV-DNA的測定方法 采用熒光定量PCR測定HBV-DNA。實時熒光定量PCR儀為美國應用生物系統公司的AB I7500 型，HBV-DNA熒光定量PCR試劑盒也由上海科華生物工程公司提供，本試劑的定量測定范圍為103～107。操作方法嚴格按說明書進行，結果真實可信。

1.3 統計學處理

采用SPSS15.0軟件，運用x2檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大三陽患者（A組）與小三陽患者（B組）的HBV-DNA定量比較

結果顯示：大三陽組的HBV-DNA陽性率為95.54%。

小三陽組的HBV-DNA陽性率為52.69%。其陽性率差異具有統計學意義（P<0.05）。并且大三陽組的HBV-DNA的平均拷貝數為7.02×107，明顯高于小三陽組。見表1。

2.2 HBsAg（+）、HBeAg（+）患者（C組）與HBsAg（+）、HBeAg（-）患者（D組）的HBV-DNA含量結果比較

如表2所示：C組HBV-DNA陽性率為71.11%。D組的HBV-DNA陽性率為22.58%，其陽性率差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.3 HBsAg（+）、HBeAb（+）患者（E組）與HBsAg（+）、HBeAg（+）患者的HBV-DNA含量比較

表3顯示E組的陽性率陽性患者的平均拷貝數均低于C組（P<0.05）。

3 討論

乙型肝炎病毒（HBV）感染是目前世界范圍內的嚴重公共衛生問題。它傳染性強，發病率高，且感染者部分易轉變成慢性肝炎，并容易繼發肝硬化、肝癌等疾病[2]。我國屬于“乙肝大國”，據我國衛生部1992～1995年全國病毒性肝炎血清流行病學調查公布的數據顯示[3]：我國人群乙肝病毒攜帶率為9.75%，總數約為1.2億，嚴重危害我國人民的生命健康。因此，采取有效的方法做好乙肝的檢測對于及時發現患者、切斷傳播及進行臨床診治均有重要的意義。

目前血清標志物的檢測方法有酶聯免疫法（ELISA法）、化學發光法、實時熒光定量PCR法、放射免疫法、膠體金法、免疫層析法等[4]。這其中ELISA法因其操作簡單、成本低廉，、方便快速、靈敏度和特異度較高等特點得到了臨床廣泛應用。是目前對HBV感染的常規檢查方法。但ELISA法的缺點是只能得到定性結果，是HBV感染的間接依據，不能及時、動態地反映體內病毒復制情況及傳染危險程度。而實時熒光定量PCR法進行HBV-DNA定量檢測是HBV感染最直接的指標，并且其特異性強、靈敏性高[5]，能直接反映乙肝病毒的復制水平及傳染性。但是HBV-DNA檢測卻不能明確非復制狀態的感染。故臨床上常常進行兩者聯合檢測。

本次檢測結果顯示，在乙肝病毒感染者中“大三陽”患者的PCR檢測結果符合率極高，達到95.54%；且病毒含量高，平均拷貝數為7.02×107，表明病毒復制活躍，傳染性極強，與此前相關報道基本一致[6-7]。這說明乙肝免疫標志物的組合HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+）能夠很好地反映乙肝的感染及傳染情況，臨床意義明確。小三陽組HBV-DNA陽性率為52.69%，平均HBV-DNA拷貝數為4.21×105，陽性率及平均拷貝數均低于大三陽組。這可能與HBeAg轉陰而產生HBe-Ab有關，患者體內乙肝病毒含量下降，傳染性降低。但這并不表示患者體內已沒有病毒復制；小三陽患者有半數以上體內仍有較高病毒載量，且有部分（本研究結果為23.66%）患者體內有很高的病毒載量（>1×107）。而HBsAg（+）、HBeAg（+）患者與HBsAg（+）、HBeAg（-）患者的HBV-DNA含量比較類似于大三陽與小三陽組的比較，結果顯示HBeAg（+）組的DNA陽性率及平均拷貝數均高于HBeAg（-）組。這再次表明HBeAg的存在與HBV-DNA的含量具有相關性。何大源等[8]研究表明，高水平的HBeAg是病毒復制的標志。而HBeAg轉陰表明患者體內的HBV-DNA的復制正在減少，這有利于了解患者的病情并對抗病毒的療效檢測提供了參考依據[9]。而對HBsAg（+）、HBeAb（+）患者與HBsAg（+）、HBeAg（+）患者進行的檢測結果證明HBeAg（+）的出現表明患者的病毒復制較少，傳染性減弱。

綜上所述，判斷乙型肝炎患者的病毒復制情況及是否具有傳染性方面，熒光定量PCR檢測HBV-DNA法要明顯優于ELISA法；但在病毒感染分析、疾病進程及HBV-DNA陰性患者的病情判斷方面，ELISA法為代表的免疫學指標有著不可替代的作用。在臨床工作中我們既需要應用免疫學指標進行乙肝病毒感染的篩檢、快速診斷及病情進展的評估，也需要相對精確了解體內HBV的復制水平；兩者結合對早期診斷HBV感染、判斷是否進行抗病毒治療及療效觀察提供科學的實驗依據，從而達到降低感染率、減緩乙肝進程、提高患者生存質量的目的。

[參考文獻]

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[2] Xin Zheng，Klaus M. Weinberger，Ralph Gehrke，et al.Mutant hepatitis B virus surface antigens（HBsAg）are immunogenic but may have a changed specificity[J].Virology，2004，329：454-464.

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[7] 劉寶芳.各型乙型肝炎患者血清HBV DNA水平與臨床的關系[J].中華肝臟病雜志，2002，10（1）：65.

[8] 何大源，黃玉嘉，楊波.乙型肝炎病毒載量與乙型肝炎兩對半之間的關系[J].檢驗醫學與臨床，2007，4（9）：822-823.

[9] 張高明，張國明，馬小波，等.乙型肝炎患者血清中抗原與病毒DNA關系探討[J].檢驗醫學與臨床，2011，8（20）：42-43.

（收稿日期：2013-03-11）