提取方法及部位對三裂葉豚草基因組DNA的影響

王學治等

摘要：利用改良的CTAB法、SDS法及斑跡抽提法提取三裂葉豚草（Ambrosia trifida L.）不同部位的基因組DNA。結果表明，改良的CTAB法提取三裂葉豚草韌皮部基因組DNA的提取效果最好。

關鍵詞：三裂葉豚草（Ambrosia trifida L.）；提取；基因組DNA；改良的CTAB法

中圖分類號：Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1447-03

三裂葉豚草（Ambrosia trifida L.）為菊科（Compositae）豚草屬（Ambrosia）一年生粗壯草本植物，高50～120 cm，有時可達170～200 cm，葉掌狀三裂，有時五裂，幾乎全部對生[1]。三裂葉豚草原產于北美洲，生命力、競爭力極強，傳播途徑多，繁殖系數大，分布范圍廣，危害大，難以治理，對農業生產和生態環境已經造成了巨大危害[2-4]。2011年，本課題組調查時發現三裂葉豚草在遼寧、上海、黑龍江、吉林、北京等省市均有分布，并且在形態上有一定差異。三裂葉豚草分子水平的遺傳變異研究可為探索其傳播規律與途徑提供一定依據。

本研究對三裂葉豚草基因組DNA提取方法及不同部位基因組DNA提取效果進行比較研究，為獲取更高質量的DNA提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

三裂葉豚草成熟植株2011年10月采集自沈陽農業大學科研基地，取其葉片、莖、韌皮部、花序軸置于裝有變色硅膠的密封袋中，干燥保存備用。

1.2 試劑

改良的CTAB提取緩沖液[5，6]：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA，1.6 mol/L

NaCl，2% CTAB；SDS提取緩沖液[7]：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% SDS；斑跡抽提緩沖液[8]：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，2%SDS，0.039 mol/L二硫蘇糖醇。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理 稱取0.015 g三裂葉豚草干燥葉片，放入研缽中加入石英砂和液氮研磨。將研磨后的粉末轉移至2 mL離心管中，分別加入1 mL改良的CATB提取緩沖液和SDS提取緩沖液。斑跡抽提法的樣品處理則不需研磨，直接將樣品放入2 mL離心管中，加入斑跡抽提緩沖液。

1.3.2 基因組DNA的提取 將2 mL離心管放入水浴鍋中65 ℃水浴1 h，斑跡抽提法則需水浴3 h；1 200 r/min常溫離心10 min取上清；加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）混合液，振蕩混勻后，1 200 r/min常溫離心10 min取上清；加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比24∶1）混合液并混勻，1 200 r/min常溫離心10 min取上清，重復兩次；加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，-20 ℃放置30 min，1 200 r/min常溫離心10 min留沉淀；加入500 μL 70%乙醇洗滌3次；干燥2 h后加入100 μL TE緩沖液溶解DNA，放置于-20 ℃保存。試驗均重復3次。

1.3.3 不同組織基因組DNA的提取 采用改良的CATB法分別提取三裂葉豚草的成熟葉片、莖、韌皮部、花序軸等組織部位基因組DNA，提取方法同“1.3.2”。試驗均重復3次。

1.3.4 基因組DNA樣品質量的檢測 用紫外分光光度計檢測提取樣品的基因組DNA純度，根據A260 nm/A280 nm判斷DNA純度；通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取樣品的基因組DNA，并用紫外凝膠成像儀觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法提取三裂葉豚草葉片基因DNA的比較

用紫外分光光度計檢測提取樣品的基因組DNA純度，根據A260 nm/A280 nm來判定DNA純度。當A260 nm/A280 nm接近1.80時，DNA純度較高，當A260 nm/A280 nm<1.80表明有蛋白等雜質，A260 nm/A280 nm接近2.00時表明RNA含量較高，DNA降解較多[9]。改良的CTAB法、SDS法、斑跡抽提法提取三裂葉豚草葉片基因組DNA的A260 nm/A280 nm分別為1.82、1.78和1.96（表1）。結果表明，改良的CTAB法提取的基因組DNA純度較高；SDS法提取的DNA含有較多蛋白等雜質；斑跡抽提法提取的DNA降解嚴重。在抽提液顏色和DNA顏色上，改良的CTAB法抽提液為綠色，沉淀后的DNA呈白色，表明此方法去除酚類等雜質效果很好；而SDS法與斑跡抽提法的抽提液為褐色，沉淀后的DNA均呈深褐色，表明這兩種方法去除酚類等雜質效果較弱。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），改良的CTAB法提取的基因組DNA無明顯拖尾，DNA條帶清晰，效果最好；SDS法提取的基因組DNA點樣孔較亮，DNA有明顯拖尾，表明樣品含有較多蛋白質、多糖等雜質，提取效果較差；斑跡抽提法提取的基因組DNA無明顯DNA條帶，DNA幾乎全部降解，效果最差。改良的CTAB法提取的DNA純度高、雜質少，是三裂葉豚草基因組DNA的最佳提取方法。

2.2 三裂葉豚草不同組織部位基因組DNA提取結果的比較

利用改良的CTAB法提取三裂葉豚草成熟葉片、莖、韌皮部、花序軸的基因組DNA，經分紫外光光度計檢測，A260 nm/A280 nm分別為1.82、1.87、1.86、1.89（表2）。利用此方法提取的不同組織部位基因組DNA質量均較好，韌皮部提取純度稍高于其他部位；不同組織部位提取基因組DNA的抽提液顏色及沉淀后的DNA顏色有差異，成熟葉片與花序軸基因組DNA抽提液為深綠色，含酚類等雜質較多；莖基因組DNA抽提液顏色為綠色，含酚類等雜質相對較少；韌皮部基因組DNA抽提液顏色最淡，含酚類等雜質最少。

對不同組織部位提取的基因組DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2）。結果表明，韌皮部基因組DNA無明顯拖尾，DNA條帶清晰，韌皮部提取質量高雜質少；莖和成熟葉片點樣孔較亮，DNA有少量拖尾，莖和成熟葉片含雜質相比韌皮部較多，DNA質量稍差；花序軸基因組DNA條帶較弱，也有少量拖尾，花序軸提取基因組DNA含量較少，雜質較多，質量最差。提取三裂葉豚草基因組DNA時，韌皮部最好，莖和成熟葉片稍差，花序軸效果最差。

3 小結與討論

3.1 提取方法

本研究對CTAB法進行了改良，高鹽能使DNA和多糖分離，使其較易析出[10]，相比普通CATB法，CTAB緩沖液中NaCl的濃度提高到1.6 mol/L。植物材料中普遍含有多酚類物質，容易氧化成棕褐色，與DNA結合形成不溶物，導致DNA純度下降，不溶物一旦形成就很難去除。酚類化合物在植物材料中存在十分普遍，所以在抽提緩沖液中加入一定量的β-巰基乙醇[11]效果較為明顯，但是過量的β-巰基乙醇能夠使DNA斷裂。經過重復試驗，在1 000 μL緩沖液中加入25 μL β-巰基乙醇較為合適。

3.2 提取部位

植物提取基因組DNA的組織取材以幼葉效果最好。但是受限于季節和野外采樣時間等因素影響，只能取到成熟葉片，成熟葉片次生代謝物質較多，提取到的DNA質量差。本研究對三裂葉豚草的其他組織（莖、韌皮部、花序軸）取樣提取基因組DNA。韌皮部提取到的基因組DNA質量最好，莖、成熟葉片次之，花序軸最差。韌皮部提取的DNA沉淀為白色，易溶于TE緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰，沒有拖尾降解的現象，適合于代替幼嫩葉片作為基因組DNA提取組織材料。

本研究中采用三裂葉豚草鮮樣提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶很弱或沒有條帶。采用干樣效果較好，可能是鮮樣中酶的活性很高，在提取過程中易使DNA降解，而干樣細胞中含水較少，使酶的活性降低，甚至部分酶失活，于是研磨時釋放出的酶對DNA的影響較小，并且干樣容易在室溫長期保存，方便在交通不便利的野外取樣運輸[12]。

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