GM—CSF與創面修復

趙鋒

糖尿病相關性潰瘍、靜脈瘀滯性潰瘍、燒傷殘余創面、深Ⅱ度燒傷創面以及各種原因不明的難愈性創面，在臨床上已經成為常見病、多發病，而關于這類疾病的治療一直是比較棘手的問題，也是多年來中外學者探討的熱點。創傷愈合是一個動態的、復雜的、多細胞協作的過程。該過程中設計的細胞包括：角質細胞、成纖維細胞、上皮細胞、巨噬細胞以及血小板等，在炎癥反應以及愈合過程中這些細胞遷移、浸潤以及增殖分化，最終修復創面。這個過程被體內的復雜的信號系統調控，包括許多生長因子、細胞因子以及化學因子，其中比較重要的有EGF、 VEGF、GM_CSF、 PDGF、CTGF以及IL等[1]。本文主要參閱有關粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granubcyte/macrophage colony-stimulating factor GM-CSF）與創面修復的研究文獻，對GM-CSF在創面修復中的作用及應用綜述如下。

1 GM-CSF的來源、理化特性以及與創面修復相關的生物學特性

GM-CSF是一種多功能生長因子，最初作為免疫增強劑應用于化療放療后以及嚴重感染等免疫低下患者。GM-CSF是由127個氨基酸組成的蛋白質分子，是具有2個N-糖基化位點和3個O-糖基化位點的糖蛋白，含有四個半胱氨酸組成的2個二硫鍵，分子量從14.5～32kd不等的9條蛋白質帶組成[2]。GM-CSF由活化的T細胞、角質細胞、內皮細胞、成纖維細胞、樹突狀細胞以及巨噬細胞等分泌，并可以通過自分泌及旁分泌的方式作用于這些細胞，影響其趨化、增殖和成熟[3-4]。創面上的GM-CSF來源于炎癥反應細胞（如：巨噬細胞、中性粒細胞）、角質細胞、內皮細胞、成纖維細胞等，其中以角質細胞為主[5]。GM-CSF在正常皮膚以及血液中含量極低，難以檢測到，形成創面或者炎癥刺激后局部皮膚以及血液中GM-CSF水平明顯升高，提示其與創面局部反應有關。GM-CSF通過與靶細胞膜上的受體結合，發揮多種生理作用。人體內有多種細胞存在GM-CSF受體，如：粒細胞、紅細胞、巨噬細胞等的前體細胞、成熟中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、漿細胞、成纖維細胞、角質細胞、內皮細胞等。人和小鼠GM-CSF受體均由α、β兩條鏈組成，其中α鏈是連接亞單位，和配體結合，β鏈主要和信號轉導有關。GM-CSF與受體結合后，刺激膜受體胞內部分的蛋白酪氨酸磷酸化，激活酪氨酸激酶，RAS以及絲裂原活化蛋白激酶等信號轉導通路，發揮其生物學效應[6-7]。

2 GM-CSF與創面愈合

GM-CSF最初作為造血刺激因子以及免疫增強劑應用于化療放療后和嚴重感染等患者。自1989年Siena等[8]發現GM-CSF在治療口腔黏膜炎以及口腔潰瘍具有良好效果后，關于GM-CSF與創面愈合的研究逐漸成為研究熱點，并取得了豐富成果。

2.1 局部注射GM-CSF對創面愈合作用的觀察：研究早期階段，由于還未研制出GM-CSF的外用劑型，在臨床試驗以及動物實驗中一般采用創面局部注射GM-CSF的方式觀察其對創面愈合效果，主要應用于各種難愈性創面。早在1999年，Da Costa等[9]把GM-CSF注射于麻風患者創面周圍，發現其可以有效地促進創面愈合。2000年，同樣采用創面局部注射的方法，Groves等[10]證實GM-CSF可以引起局部組織中炎性細胞浸潤增加，并誘導角質細胞增殖；激活單核巨噬細胞，誘導表皮細胞遷移，并進一步調節細胞因子的產生表達從而促進瘀滯性潰瘍，壞疽性膿皮病以及手術切口的愈合。2001年，Fernberg等[11]將GM-SCF局部注射到癌癥手術前后放療導致的慢性潰瘍創面，并取得了顯著療效。局部注射GM-CSF可以促進創面愈合在動物實驗中也得到有力證實。2002年，Vargel等[12]通過藥物外滲的方法制作了大鼠皮膚軟組織潰瘍模型，并將GM-CSF局部注射到潰瘍創面周圍，發現其可以有效地促進皮膚軟組織壞死創面或者潰瘍創面的愈合。糖尿病繼發性創面由于微血管病變、周圍神經性病變等原因導致細胞增殖受抑和膠原代謝障礙，較難愈合，一直是困擾臨床的難題，因而成為研究熱點。在既往研究中，通過創面局部注射GM-CSF或者是均勻滴用GM-CSF均可以促進糖尿病足慢性神經性潰瘍和糖尿病脂性漸進性壞死患者小腿慢性潰瘍的愈合，且復發率低[13]。中外學者均有研究表明，糖尿病小鼠創面中GM-CSF較正常情況下有所減少。方勇等[14]觀察到傷后3天糖尿病小鼠創面愈合率較對照組明顯降低，傷后7天差異最明顯，糖尿病組中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤在創面愈合早期顯著少于對照組，而在后期較對照組略為增多。同時，通過ELISA法檢測不同時段創面組織中GM-CSF的表達，發現糖尿病組和對照組創面GM-CSF均于創面形成后第1天即有明顯升高，但是糖尿病組到達峰值時間明顯延遲。Fang等[15]也觀察到在糖尿病小鼠創傷模型早期，糖尿病小鼠創面表達GM-CSF的量較正常小鼠下降了50%。這從另外一個角度說明，GM-CSF在創面愈合中的重要作用。

2.2 局部外用GM-CSF水凝膠對創面愈合作用的觀察：隨著外用GM-CSF劑型的出現，局部外用GM-CSF是否可以加速創面愈合成為許多學者研究的熱點。深Ⅱ度燒傷創面因為燒傷深度較深且不具有植皮手術指征，保守治療一直是主要治療方案，療程相對較長，容易感染，成為治療難點。Zhang等[16]將GM-CSF水凝膠應用于深Ⅱ度燒傷創面，并對創面全部愈合的時間以及不同時間點創面愈合率等指標進行分析，證實GM-CSF水凝膠可以顯著促進深Ⅱ度燒傷創面的愈合。燒傷殘余創面常在深度燒傷治療后期出現于Ⅲ度燒傷創面皮片間隙，深Ⅱ度創面，以及取皮較深的供皮區，肉芽蒼老、水腫，在肉芽創面或已愈皮膚上出現潰瘍或糜爛面，難以治愈。邱學文等[17]將重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠局部外用于燒傷殘余創面，并觀察用藥后不良反應和創面愈合時間，以及不同時間點的創面愈合率、總有效率，證實局部外用rhGM-CSF凝膠能促進燒傷后殘余創面愈合，且有較好的安全性。

2.3其他有關GM-CSF與創面修復的報道：關于干細胞以及祖細胞的研究有很多，并且涉及各個領域，已經應用到創面治療中。在關于干細胞促進創面愈合的機制研究中，發現由干細胞分化而來的子代細胞分泌的細胞因子是促進創面愈合的重要因素。Templin等[18]將造血祖細胞及其培養液注射到鼠創面，發現可以促進創面成纖維細胞、血管內皮細胞以及上皮細胞增殖與分化，從而促進創面修復。檢測發現造血祖細胞分泌的細胞因子以及培養液成分中含有GM-CSF。無獨有偶，Lee等[19]將人胚胎干細胞來源的前體上皮細胞培養液局部外用并注射到創面周圍，觀察發現可以加速創面肉芽組織的生長以及再上皮化并可以增強已愈合創面的強度和韌性，通過對該培養液成分的分析發現，其含有GM-CSF等細胞因子。局限性腸炎以及慢性潰瘍性結腸炎等消化道炎癥的一個重要體征就是腸粘膜潰瘍，具有難治愈和反復發作等特點，是困擾臨床的難題。Bernasconi等[20]研究證實GM-CSF在治療這類疾病中有確切的效果，可以促進損傷粘膜上皮的修復，加速潰瘍的再上皮化，減輕臨床癥狀，并檢測到在治療過程中單核細胞數量增加。

3 GM-CSF促進創面愈合的機制

慢性創面愈合與組織修復的基本病理生理過程包括炎癥反應期、細胞增殖期和組織重塑期，而急性創面的出現還往往伴隨出血及止血期，這幾個過程相互重疊而又按一定順序進行。研究證實GM-CSF可以啟動并參與創面修復的每一個過程[10]。

3.1 GM-CSF與止血期：Kaplan 等[21]發現局部注射GM-CSF可以加快損傷部位出血速度。2007年，Moosbauer 等[22]進一步研究發現GM-CSF可以通過聯合血小板活化因子促進組織因子的轉錄和釋放，加速止血過程。

3.2 GM-CSF與炎癥反應期：炎癥反應是一個復雜的過程，各種炎性因子、細胞因子以及細胞相互影響，相互作用。其中中性粒細胞和巨噬細胞的滲出和吞噬作用是炎癥反應的重要特征，可以吞噬和降解細菌、免疫復合物、異物以及壞死組織碎片，發揮抗感染和清創作用，是創面修復的前提和基礎，是愈合過程中的重要環節。研究證實，GM-CSF對中性粒細胞和巨噬細胞具有趨化作用，可以增強中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬作用，加速局部壞死組織的脫落及對入侵細菌的防御能力；并可以促進巨噬細胞合成分泌有利于創面愈合的細胞因子和生長因子，如：PDGF、FGF、EGF、VEGF等[5，23-24]。Canturk[25]給予小鼠全身應用GM-CSF，然后制作切割傷模型，觀察血液中性粒細胞計數和功能，皮膚組織切片，以及皮膚中羥基脯氨酸含量，然后和應用生理鹽水的對照組比較，發現GM-CSF可以顯著增加血液中性粒細胞的計數并可以增強其吞噬功能，并且可以增強愈合組織的韌度。2008年，Kim [26]通過非侵入性的免疫熒光成像技術結合中性粒細胞遺傳標記呈現了炎癥過程中中性粒細胞向創面的浸潤以及增殖的動態過程，為炎癥過程中中性粒細胞的浸潤提供了更為直觀形象的證據；而GM-CSF是該過程的強烈刺激因子，甚至可以達到像金黃色葡萄球菌一樣的刺激效果。Fang等[24]制作GM-CSF基因敲除小鼠皮膚損傷模型，觀察傷口愈合率、再上皮化程度以及新生血管密度，并和對照組正常小鼠對比，發現以上觀察指標明顯低于對照組，且創面炎性細胞浸潤顯著減少，創面IL-6、單核細胞趨化蛋白、巨噬細胞炎性蛋白的表達明顯降低。這從相反的角度表明：GM-CSF在炎癥反應期可以分泌相關炎性因子和細胞因子，趨化炎性細胞浸潤并增強炎性細胞功能，在炎癥期發揮重要功能。

3.3 GM-CSF與增生期：各種難愈性創面的修復過程往往伴有慢性炎癥，這種修復過程一般首先通過肉芽組織增生、溶解、吸收損傷局部的壞死組織以及其他異物，并填補組織缺損，同時創緣和創面基底也有上皮組織增生，覆蓋于肉芽組織表面，完成修復。肉芽組織在組織損傷后2～3天內即可出現，由新生薄壁的毛細血管以及增生的成纖維細胞構成，并伴有炎性細胞浸潤，這一過程包括：血管生成、成纖維細胞增殖和遷移、細胞外基質成分的積聚和纖維組織的重建。作為肉芽組織主要成分細胞的成纖維細胞，是創面修復過程中最重要的細胞，在肉芽組織形成、傷口收縮，細胞外基質及膠原合成、瘢痕形成等方面起重要作用。已有研究證實，正常人皮膚成纖維細胞表面表達GM-CSF受體[27]。Postiglione等[28]研究表明GM-CSF能刺激成纖維細胞表達GM-CSF受體以及細胞增殖，還能促進細胞肌動蛋白和纖粘連蛋白表達，增加細胞外基質合成。另外，GM-CSF對成纖維細胞的刺激作用似乎隨創面部位不同而變化。Brem等[29]在慢性創面不同部位取活性組織，提取成纖維細胞并在體外培養，嚴格傳代，使其細胞保留原有的表型特征，然后將GM-CSF作用于細胞，觀察發現：創面愈合遲滯創緣來源的成纖維細胞幾乎沒有遷移能力，而愈合活躍創緣的成纖維細胞遷移最活躍，創面基底來源的成纖維細胞遷移活性居中。雖然大量研究表明GM-CSF可以增強成纖維細胞的遷移、分化、增殖以及合成能力，但是并非所有的實驗結果都是支持這個結論，Shao等[30]在體外培養條件下將GM-CSF作用于成纖維細胞，沒有觀察到GM-CSF對纖維細胞的增殖具有明顯的促進作用。這種差別也許和實驗條件、觀察指標、檢測方法有關，也可能還有一些影響細胞增殖分化的因素需要進一步研究。

新生毛細血管作為肉芽組織的重要組成部分，為細胞分化增殖提供營養成分，在組織再生與創面修復過程起著至關重要的作用。大量研究表明，GM-CSF能夠促進內皮細胞的趨化、增殖，從而加速肉芽組織中的血管形成[5]。Wang 等[31]發現GM-CSF能誘導培養基中鼠骨髓來源的內皮祖細胞增殖分化，其細胞表現出典型 的內皮細胞樣形態，并形成集落內皮細胞。Fang等[32]研究發現，GM-CSF基因剔除小鼠燒傷后，創面中新生血管化較野生型小鼠明顯減少，創面愈合時間延遲，說明GM-CSF通過可以調控創面愈合過程中的血管新生而促進創面修復。

創面修復過程中，首先是肉芽組織增生吸收清除致病因子以及壞死組織，填補組織缺損，然后是上皮組織增生覆蓋于肉芽組織之上最終完成創面修復，所以上皮組織增生是創面修復過程中關鍵的環節。中外學者均有相關報道，認為GM-CSF可以促進上皮組織增生。方勇等[33]將GM-CSF凝膠用于治療糖尿病小鼠創面，發現GM-CSF可以顯著加速創面再上皮化，增加膠原蛋白合成從而促進創面愈合。國外也有相應研究證實，在創面愈合增生期GM-CSF可以刺激新生角化上皮細胞增殖、遷移、分化，從而加速創面的再上皮化[5，34]。

4 展望

各種原因導致的難愈性創面在臨床中已經成為常見病、多發病，治療方法一般包括手術以及保守治療。但是許多患者由于年齡、一般身體狀況以及思想傳統等原因或者受經濟限制而選擇保守治療。目前基礎實驗以及臨床試驗的大部分結論均證實GM-CSF具有促進難愈性創面愈合的作用，GM-CSF參與到創面修復的各個環節，其參與早期炎性反應階段的分子生物學機制研究的相對較多，具體機制相對清楚。GM-CSF調節創面組織生長促進修復的具體機理研究的相對較少，目前相關數據較少，將成為進一步研究的熱點問題。另外，關于GM-CSF促進創面的研究多數以創面局部注射或者外用為主，目前認為創面周圍注射途徑不僅創面愈合速率要比局部外用要快，而且用藥劑量要更加標準，但是大面積創面周圍注射尚存在諸多不便。如何更為科學地應用GM-CSF治療難愈性創面，以及如何合理地與其他外用藥物或者創面修復技術聯合應用，尚待進一步探討。

[參考文獻]

[1]Barrientos，Stojadinovic O，Golinko MS，et al.Growth factors and cytokines in wound healings[J].Wound Repair Regen，2008，16（5）：585-601.

[2]陳文超，艾曉杰，喬中東.人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子研究進展[J].上海交通大學學報，2004，22（2）：204-207.

[3]Tanaka M，Dykres PJ，Marks R.Keratinocyte growth stimulation by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor （GM-CSF） [J].Keio J Med，1997，46（4）：184-187.

[4]Tarr PE.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and the immune system [J].Med Oncol，1996，13（3）：133-140.

[5]Mann A，Breuhan K，Schirmacher P，et al.Keratinocyte-derived granulocyte-macrophage colony stimulating factor accelerates wound heasling；Stimulation of keratinocyte proliferation， granulation tissue formation， and vascularization[J].Invest Dermatol，2001，117（6）：1382-1390.

[6]Prevost JM，Farrell PJ，Iatrou K，et al.Determinants of the functional interaction between the soluble GM-CSF receptor and the GM-CSF receptor beta-subunit[J].Cytokine，2000，12（3）：187-197.

[7]Montagnani S，Postiglione L，Giordano-Lanza G，et al.Granulocyte macrophage colony stimulating factor（ GM-CSF） biological actions on human dermal fibroblasts[J].Eur J Histochem，2001，45（3）：219-228.

[8]Siena S，Brgi M，Brando B，et al. Circulation of CD4（+） hematopoietic stem cells in the peripheral blood of high-dose cylophsphamide-treated patients enhancement by intravenous recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor [J].Blood，1989，74（6）： 1905-1914.

[9]Da Costa RM，Ribeiro JFM，Aniceto C，et al.Randomized， double-blind，placebo-controlled， dose-ranging study of granulocyte-macrophage colony stimulating factor in patients with chronic venous leg ulcers[J].Wound Repair Regen，1999，7（1）：17-25.

[10]Groves RW，Schmidt-Lucke JA. Recombinant human GM-CSF in the treatment of poorly healing wounds[J].Adv Skin Wound Care，2000，13（3） Pt 1 ：107-112.

[11]Fernberg JO，Brosjo O，Friesland S，et al.GM-CSF at relatively high topic concentrations can significantly enhance the healng of surgically induced chronic wounds after radiotherapy[J].Med Oncol，2001，18（3）：231-235.

[12]Vargel I，Erdem A，Ertoy D，et al. Effects of growth factors on d，oxorubicin-induced skin necrosis： documentation of histomorphological alteration of histomorphological alterations and early treatment by GM-CSF and G-CSF[J].Ann Plast Surg，2002，49（6）：646-653.

[13]Kari R，Tapani R.Healing of Chronic Leg Ulcers in Diabetic Necrobiosis Lipoidica with Local Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor Treatment[J]. J Diabet Complicati，1999，13：115-118.

[14]方勇，程瑞杰，王瑩，等.糖尿病小鼠創面愈合過程中炎癥細胞和GM-CSF表達[J].上海交通大學學報（醫學版），2007，27（2）：174-177.

[15]Fang Y，Shen J，Yao M，et al.Granulocyte-macrophage colony stimulating factor enhances wound healing in diabetes via upregulation of proinflammtory cytokines[J].Br J Dematol 2010，162（3）：478-486.

[16]Zhang L，Chen J，Han C.Amulticenter clinical trial of recombinant human GM-CSF hydrogel foe the treatment of deep second-degree burns[J].Wound Repair Regen，2009，17（5）：685-689.

[17]邱學文，王甲漢，楊磊，等.重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子治療燒傷后殘余創面[J].實用醫學雜志，2011，27（7）：1195-1197.

[18]Templin C，Grote K，Schledzewski K，et al.Exvivo expanded haematopoietic progenitor cells improve dermal wound healing by paracine mechanisms[J].Exp Dermatol，2009，18（5）：453-455.

[19]Lee MJ，Kim J，Lee KI，et al.Enhancement of wound healing by secretory factors of endothelial precursor cells derived from human embryonic stem cells[J].Cytotherapy，2011，13（2）：165-178.

[20]Bernasconi E，Favre L，Maillard MH，et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor elicits bone marrow-derived cells that promote efficient colonic mucosal healing[J].Inflamm Bowl Dis，2010，16（3）：428-441.

[21]Kaplan G，Walsh G，Guido LS，et al.Novel responses of human skin to intradermal recombinant granulocyte- macrophage colony-stimulatingfactor： Langerhans cell recruitment， keratinocyte growth ，and enhanced wound healing [J].J Exp Med，1992，175（6）：1717-1728.

[22]Moosbauer C，Morgenstern E，Cuvelier SL，et al.Eosinophils are a major intravascular location for tissue factor storage and exposure [J].Blood，2007，109（3）：995-1002.

[23]Jones TC.The effects of rhGM-CSF on acrophage function[J].Eur J Cancer，1993，29A（S3）：10-13.

[24]Fang Y，Gong SJ，Xu YH，et al.Impaired cutaneous injection of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor knockout mice[J].Br J Dermatol，2007，157（3）：458-465.

[25]Canturk NZ，Esen N，Vural B，et al.The raltionship between neutrophils and incisional wound healing[J].Skin Pharmacol Appl Skin Physiol，2001，14（2）：108-116.

[26]Kim MH，Liu W，Borjesson DL，et al.Dynamics of neutrophil infiltration during cutaneous wound healing and infection using fluorescence imaging[J].J Invest Dermatol，2008，28（7）：1812-1820.

[27]Postiglione L，Montagnani S，Riccio A，et al.Expression of GM-CSF receptor and/in vitro effects of GM-CSF on human fibroblasts[J].Life Sci，1998，63（5）：327-336.

[28]Postiglione L，Ladogana P，Montagnani S，et al.Effect of granulocyte macrophage-colony stimulating factor on extracellulor matrix deposition by dermalfibroblasts from patients with sclerodema[J].J Rheumatol，2005，32（4）：656-664.

[29]Brem H，Golinko MS，Stojadinovic O，et al.Primary cultured fibroblasts derived from patients with chronic wounds： a methodolgy to produce human cell lines and test putative growth factor therapy such as GM-CSF[J]. J Transl Med，2008，6：75.

[30]Shao DD，Suresh R，Vakil V，et al.Pivotal Advance： Th-1 cytokines inhibit， and Th-2 cytokines promote fibrocyte differentiation[J]. J Leukoc Biol，2008，83（6）：1323-1333.

[31]Qi Ru，WangFeng，Wen Biao Zhu.GM-CSF accelerates proliferation of endothelial progenitor cells from murine bone marrow mononuclear cells in vitro [J].Cytokine，2009，45（3）：174-178.

[32]Fang Y，Gong SJ，Xu YH，et al. Impaired cutaneous wound healing in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor knockoutmice [J].Br J Dermatol，2007，157（3）：421-431.

[33]程瑞杰，方勇，俞為榮.粒細胞巨噬細胞集落刺激因子對糖尿病小鼠創面愈合的作用[J].上海交通大學學報，2007，27（4）：415-418.

[34]Mann A，Niekisch K，Schirmacher P，et al.Granulocyte- macrophage colony stimulating factor is essential for normal wound healing[J].J Investing Dermatol Symp Proc，2006，11（1）：87-92.

[收稿日期]2013-02-23 [修回日期]2013-03-21

編輯/李陽利