核轉染儀輔助轉染肝素酶基因siRNA有效性的實驗研究

張彩虹?董宏偉

摘 要 目的 研究核轉染儀轉染肝素酶基因siRNA的有效性。方法 采用核轉染儀輔助轉染技術和常規脂質體轉染技術轉染針對肝素酶基因啟動子區和編碼區設計siRNA，并通過實時定量RT-PCR，Western blot等技術檢測2種轉染技術轉染后，肝癌細胞SMCC-7721在48h、72h和96h時肝素酶基因表達情況。結果 2種轉染技術在轉染后48h，從mRNA和蛋白水平上均能成功干擾掉肝素酶基因；但在轉染后72h，脂質體轉染組基因很快恢復表達，而核轉染儀轉染組基因仍保持沉默；在96h后，2組的肝素酶基因均恢復表達。結論 核轉染儀可有效轉染肝素酶基因siRNA，并使肝癌細胞SMCC-7721的肝素酶基因表達下調，且維持較長時間。

關鍵詞 核轉染儀 肝素酶基因 肝癌細胞

RNA干擾（RNA interferance，RNAi）是近些年在分子生物學中迅速發展起來的一項新技術，是基因功能研究最常用手段之一[1]；它包括轉錄水平（Transcriptional gene silencing ，TGS）和轉錄后水平（post-transcriptional gene silencing， PTGS）2種基因沉默方式[2]。通常所說的RNAi指的是PTGS，通過基因編碼區設計的小分子RNA（siRNA）能與對應的mRNA靶序列特異結合，并使靶序列降解，從而使基因沉默[1]。由于基因上游轉錄水平持續活躍，不停地產生大量mRNA，要使基因持久沉默，就得不停地給予外源性siRNA。因此，PTGS的干擾效率不高。研究發現植物細胞存在高效率的TGS現象，即在DNA水平上通過基因5端啟動子區域DNA甲基化或組蛋白去乙酰化形式使基因永久沉默；這種現象被稱為siRNA指導下的DNA甲基化（siRNA-direct DNA methylation）或組蛋白修飾[3，4]。2004年Kawasaki 等[5]首次發現在人細胞也存在TGS現象。理論上講，一次給予針對基因5端啟動子的siRNA，就可使該基因由于表觀遺傳修飾而保持持久沉默[6～8]。因此，TGS相對于PTGS的研究更具有經濟性和臨床應用前景[9]。肝素酶基因（heparanase gene，HPA）位于人染色體4q 21.3，其5端啟動子區域含有CpG島，表明基因的表達受甲基化等表觀遺傳學機制調控[10]；HPA在肝癌、乳腺癌、大腸癌、肺癌和淋巴瘤等多種腫瘤中都有高水平的表達[11～13]，主要參與腫瘤轉移和侵襲。然而，TGS的沉默對象是位于細胞核中的非編碼DNA調控序列，siRNA必須進入細胞核內才能發揮作用。近年由于核轉染技術發展，尤其是德國AMAXA公司研發的NucleofectorTM專利創新技術，它采用電穿孔技術與細胞類型特異的核轉染溶液結合方法，直接將DNA序列轉入細胞核內，即使是常規轉染無法轉染的原代培養細胞和不分裂細胞也可成功轉染，其轉染率可高達70%以上，速度快，轉染2h后就能發揮作用，操作簡單方便[14，15]。但目前尚未見該技術用于TGS研究，既往TGS研究采用常規脂質體轉染技術。本研究采用HPA基因為模型，比較核轉染儀輔助轉染技術和常規脂質體轉染技術在肝素酶基因沉默效果和沉默維持時間上的差別。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養基、胎牛血清、含100 U/mL青霉素、100 U/InL鏈霉素的青鏈霉素混合液均購自Gibco公司，SMMC-7721細胞（中科院上海細胞所），NucleofectorTM電轉試劑盒（德國Amaxa公司），德國Amaxa公司單孔核電轉儀，型號2b（北京達科維生物公司提供），Trizol試劑（invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（fermentas公司），2×Taqmix（ABI公司），兔抗人肝素酶多克隆抗體、HPR標記羊抗兔抗體（Santa公司），PVDF膜（ Santa 公司），發光試劑盒，Transwell小室（BD公司）；Lipofetmiane 2000試劑盒（美國Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 從液氮中取出SMMC-7721細胞，42℃熱水迅速復蘇，用高糖DMEM加10%的血清和1%的青鏈霉素混合液，放入37℃、5%CO2、常規濕度培養箱中培養。

1.2.2 干擾片段設計 針對肝素酶基因啟動子區，分別設計多個干擾片段（siRNA），在預實驗中篩選出干擾效果較理想的siRNA；TGS的 siRNA為：GAGGAAGUGCUAGAGACUCU；同時對HPA基因編碼區設計RNAi片段：CCUUAAGAAGGCUGAUAUU（圖1），整個設計合成由美國BIOO公司協助完成，設計完成后的siRNA經過DNAMAN軟件與原基因組BLAST以后，與肝素酶基因的啟動區完全匹配。

1.2.3 基因轉染 實驗分為3個組，核轉染儀組，脂質體轉染組及對照組（不含siRNA）。在轉染前1 天，將對數生長期的SMMC-7721細胞按l×106個鋪于10cm培養皿中，細胞生長至90%融合時進行轉染，方法按照Amaxa電轉染試劑盒產品說明書進行，即選擇多個參數進行預實驗，優化好轉染參數，將培養在對數生長期的106個肝癌細胞與siRNA混合，加入轉染液，重懸細胞，放入轉染杯，在電轉染儀中進行轉染，將轉染后的細胞放入37℃，5%CO2培養箱中繼續培養。脂質體常規轉染采用Lipofetmiane 2000試劑盒，具體操作按說明書進行。

1.2.4 RT-PCR 分別收集轉染后48h、72h和96h的細胞，trziol一步法分別提取細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒將其逆轉為cDNA后，PCR檢測各組細胞肝素酶基因表達情況。HPA基因上游引物：ATGTGGAGGAGAAGTTACGG，下游引物：TGAGTTGGACAGATTTGGAA；PCR條件為94℃/ 3min； 94℃ /30s；55℃/ 30s；72℃ /45s，共32個循環，最后72℃ 延伸10min。

圖1 HPA基因啟動子siRNA設計示意圖

1.2.5 實時半定量RT-PCR HPA基因上游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC，下游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC。采用EverGreen I PCR試劑盒（Biotech）進行實時熒光半定量PCR反應，操作按說明進行，一管中不加模板用作陰性對照。反應液混勻后，置于SLAN熒光定量PCR儀中。設立程序：95℃ /5min預變性后，94℃/30s， 60℃退火45s，72℃延伸45s， 循環40次，最后72℃充分延伸10min。PCR反應結束后從55℃到95℃按每級0.5℃遞增作出溶解曲線，分析每個PCR反應的溶解曲線以確保PCR擴增產物的特異性。每個反應重復3次。內參β-actin作一相對標準曲線，根據內參和目的基因的Ct值計算該基因相對表達量。

1.2.6 Western blot檢測 將轉染后48h，72h和96h的細胞裂解，收集蛋白質，Bradford法測定含量。蛋白變性后每孔上樣70μg，經10%SDS一聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白后轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶封閉1h。用5%脫脂牛奶稀釋一抗（β-actin以1：2000稀釋，兔抗肝素酶抗體以1：500比例稀釋）4℃搖床孵育過夜，PBST洗膜3×10 min，加入相應的二抗（PBST1：1000稀釋）室溫溫育1 h，PBST洗膜3×10 min，化學發光試劑檢測蛋白質印跡，X線暗室曝光成像。

2 結果

2.1 實時半定量RT-PCR定量檢測核轉染儀和脂質體轉染技術對基因沉默效果

定量檢測結果示：在轉染48h后，2種方法對HPA基因mRNA表達幾乎達到100%的抑制；72h后，脂質體轉染組HPA基因表達有所恢復，而核轉染組仍保持100%的抑制；在轉染96h后，2組HPA基因均恢復表達，表達相對量接近對照組的一半。（圖2）

2.2 Western雜交檢測核轉染組和脂質體轉染組對HPA基因沉默效果

western 雜交結果顯示，轉染后48h，2組干擾細胞的HPA基因蛋白表達完全沉默；72h后，脂質體組HPA基因蛋白再次表達，而核轉染組HPA仍保持沉默；96h后，2組細胞的HPA蛋白恢復表達（圖3）。

圖2 實時定量RT-PCR檢測核轉染組和脂質體轉染組轉染48h、72h、96h后HPA表達情況

圖3 western blot 檢測核轉染組和脂質體轉染組分別在轉染后48h、72h、96h后，HPA表達情況

3 討論

惡性腫瘤細胞的浸潤、轉移一直是腫瘤臨床治療關鍵和難點，而肝素酶基因被證明在腫瘤的侵潤轉移中起著重要作用[12]。隨著腫瘤發展分子機制闡明，腫瘤的基因治療成為目前研究重點之一；近年用RNAi技術在多種不同腫瘤細胞中成功干擾多種靶基因表達，抑制腫瘤細胞生長，已成為目前腫瘤治療研究熱點[1]。這些基因除腫瘤基因，還包括抗凋亡分子、端粒酶、生長因子受體、某些信號分子等基因。應用RNAi 技術，還可探索各種基因功能及相互作用，為篩選新的藥物靶基因提供便利。已有實驗證明，通過RNAi沉默肝素酶基因，可以阻止部分腫瘤的侵襲和轉移[16]。

傳統的靶向腫瘤基因RNAi治療是建立在轉錄后水平上，其缺點是：基因的啟動子活躍，靶基因能被持續轉錄，要想使基因長期沉默，需要不間斷地給予siRNA。而目前由于用于人類腫瘤基因治療載體存在許多問題，建立長期穩定的特異性在瘤細胞內表達的治療基因載體并用于臨床治療尚不成熟。用于臨床上實驗性治療藥物多為體外合成并經化學修飾的寡核苷酸，不僅價格昂貴，半衰期短，且有一定細胞毒性；要使靶基因沉默，需長期給藥，不僅療效受到影響，毒性很大，也不經濟。而轉錄水平的RNAi不僅誘導基因調控序列同源靶序列被降解，還可以誘導異染色質形成，DNA甲基化，組蛋白修飾等表觀遺傳學改變，使基因不能轉錄；理論上講，一次給予針對5端啟動子的siRNA就可使該基因永久沉默，因此對于轉錄水平的RNA干擾，有著更廣泛地應用前景[9]。要實現TGS， 必須要將siRNA有效轉入細胞核內，本項研究是通過核轉染儀將設計在肝素酶5端的siRNA轉入肝癌細胞，以證實轉錄水平干擾的優越性。

研究首先針對細胞核內的啟動子區，設計siRNA靶點，同時對胞漿內的mRNA區設計相應siRNA靶點，通過PCR初步檢測發現，2組細胞在干擾發生48h后，基因同時都被沉默；72h時，脂質體轉染組細胞基因沉默效果明顯下降，而核轉染組細胞基因沉默效果仍然很明顯，96h時，2組細胞的肝素酶基因再次同時表達出來，RT-PCR證實這個結果。從Western blot實驗也進一步證明，核轉染技術的轉錄水平沉默肝素酶基因比脂質體的轉錄水平沉默肝素酶基因細胞，肝素酶的沉默時間維持更長些；但是96h的時候，2組肝素酶蛋白又再次表達。相對于脂質體的轉錄后基因沉默，核轉染轉錄水平的基因沉默維持時間相對更持久，但并未達到先前預期的基因永久沉默目的。

盡管本次實驗從基因水平和蛋白水平都無法證實，TGS對基因有著永久沉默作用；但是相比于PTGS，TGS對基因沉默維持時間顯然有所延長。上述結果與理論上轉錄水平干擾能持久沉默基因的推測仍然有較大差距，其原因可能有：（1）細胞核轉染的效率；電轉染只有一少部分siRNA被轉染進核中，多數siRNA還是留在胞漿內被降解，可能會造成實驗結果不理想。在實驗中，用普通的脂質體轉染HPA調控區siRNA，TGS幾乎無任何基因沉默作用，而轉染編碼區siRNA， PTGS卻有明顯基因沉默效應（結果未公布），說明TGS必須用有效的核轉染技術。（2）不同細胞或基因對TGS的效果不同。可能不同細胞或基因表達調控受多種機制影響，表觀遺傳學因素只是其中一種。（3）表觀遺傳學控制基因的表達是可逆的。

雖然如此，本實驗為TGS在腫瘤基因治療中的研究提供實驗基礎，至于TGS的作用機制，以及是否針對CpG島或轉錄因子結合位點的RNAi更有效，一次RNAi導致的表遺傳學改變能維持多長時間（細胞能傳多少代），是否含有CpG島的基因更適合針對啟動子的RNAi等等，則需要更多實驗加以論證。

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