Wnt/β—catenin 信號通路及其在胰腺癌發生發展中的作用

吳夢瑤?謝宇鋒?陶敏

摘 要 Wnt信號傳導通路是廣泛存在于真核生物中一條高度保守的信號通路，β-連環蛋白（β-catenin）是Wnt信號通路中的關鍵調控因子，通路中的效應因子在腫瘤的侵襲轉移和增殖凋亡過程中發揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路與胰腺癌關系密切，并在腫瘤形成的不同階段發揮不同的作用，抑制此通路能起到抗腫瘤作用，有可能成為候選的靶向治療靶點，值得進一步研究。本文就Wnt/β-catenin通路的信號傳導途徑及其在胰腺癌發生發展過程中的作用作一綜述。

關鍵詞 Wnt β-catenin 胰腺癌

Wnt是一種作用于動物發育過程中多個階段的分泌型糖蛋白，哺乳動物基因組中共有19種Wnt信號基因。Wnt信號通路可分為經典的Wnt信號途徑（canonical Wnt/β-catenin pathway）與非經典的Wnt信號途徑（noncanonical Wnt/β-catenin pathway）2種類型。經典的Wnt信號途徑以Wnt配體與跨膜受體卷曲蛋白（Frizzled）和輔助性受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP-5/6）2種受體的結合為起始點，最終導致β-catenin在細胞質中積聚入核后與核內轉錄因子T細胞因子（TCF）/淋巴樣增強因子（LEF）結合形成復合體，調控靶基因的表達。

1 Wnt/β-catenin信號通路及其生物學作用

1.1 Wnt/β-catenin信號通路的組成

目前認為Wnt/β-catenin信號通路主要由以下幾種蛋白構成：Wnt、Frizzled（FZD）、β-catenin、LRP5/6、松散蛋白（Dsh）、酪蛋白激酶I（CKl）、結直腸腺瘤性息肉蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、軸蛋白（Axin）、TCF/ LEF和泛素蛋白（Ub）等。哺乳動物中存在的10種FZD受體蛋白都是7次跨膜受體，并且有較大的胞外N末端富半胱氨酸區（CRD），能夠提供Wnt結合的主區域[1]。CRD有多個結合層面，其中一個包含能與Wnt分子相互作用的疏水凹槽。Wnt信號通路激活時，Wnt蛋白結合一個FZD蛋白與LRP5/6蛋白組成的異源二聚體受體復合物，最終導致β-catenin在胞質中積累并轉運到細胞核[2]，核中TCF與β-catenin結合后轉化為TCF/β-catenin轉錄激活因子，最終啟動WNT信號通路下游特異性靶基因的轉錄[3、4]。當 FZD/LRP受體未被結合時，胞質中β-catenin與GSK-3β、APC、CKl和Axin構成一個多蛋白復合物。β-catenin的Ser33/Ser37/Thr41位點受到GSK-3β磷酸化后立即被蛋白酶體泛素化降解，使其保持在一個較低水平。β-catenin的Tyr654位點磷酸化后，C末端更易被眾多轉錄共激活因子綁定而促進轉錄，這些轉錄共激活因子是常規[6]。β-catenin在細胞質與細胞核之間穿梭的細節仍不清楚，不過最近有研究證明微管的作用和主動運輸與其相關[7]。還有研究表明β-catenin會瞬時有序地與不同的核孔成分結合以順利通過核孔，在這些成分中Nup358對于β-catenin在核易位過程中與核孔的對接與斷連尤其重要[8]。TCF根據不同的細胞內環境產生促進或抑制靶基因的作用[9]。昆蟲的基因組只編碼一種TCF，而脊椎動物中則有4種，TCF1、TCF3、TCF4、LEF1，它們都能與β-catenin發生反應，在脊椎動物中存在的剪接變異體使情況更為復雜[4]。在脊椎動物中，有的TCF更傾向于阻遏Wnt/β-catenin的靶基因，而更多的則是激活劑[10]。近期有研究認為蛋白質Jerky/Earthbound能調節β-catenin-TCF活性，且具有細胞類型特異性[11]。除TCF外β-catenin也能結合各種其他轉錄因子并誘導其靶基因的轉錄，例如在小鼠胚胎干細胞中，β-catenin能夠與多能性轉錄因子Oct4結合而誘導其下游靶基因的轉錄[4]。

Lyashenko等研究證明β-catenin的生物學功能取決于它在信號通路和組織學結構上的雙重角色。缺乏β-catenin的小鼠胚胎干細胞無法分化出中胚層胚葉，并且無法形成神經上皮，兩者都會影響到分化過程中細胞與細胞間的連接，而重新加入β-catenin后細胞間粘附點得到了修復，神經上皮組織也可繼續形成，但中胚層的形成無法恢復，因為其需要實現完整的β-catenin轉錄過程[12]。在背神經管和神經嵴細胞的發育過程中，β-catenin的缺失會比僅僅抑制其表達造成更明顯的表型，進一步證明β-catenin的作用會產生疊加效應[13]。

1.2 Wnt信號通路和干細胞自我復制

WNT通路在維持干細胞方面的作用已引起廣泛的關注。干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下它可以分化成多種功能細胞，這主要取決于外界的細胞信號，這些信號包含能夠短期限制干細胞數量的信號中心[14]。

已有研究證明Wnt是干細胞的關鍵信號，在胃腸、皮膚、毛囊和乳腺等器官中都發現事先標記過的干細胞[15、16]。世系追蹤技術證實Wnt是多種成體干細胞的自我復制信號蛋白，Wnt蛋白或Wnt信號通路激動劑可維持干細胞的生長。早期有研究表明小鼠TCF4突變導致腸干細胞的損傷，隨后出現組織的分解。毛囊中的Wnt信號通路在干細胞和祖細胞生物學中起到多重作用。表達DKK以阻斷Wnt信號通路后，毛囊和乳腺等其他皮膚附屬結構的組織特異性干細胞受到很大程度的損失。相反，在造血和毛囊系統中激活Wnt信號通路均可導致干細胞的擴增[17]。Wnt通路激動劑R-Spondin可以維持干細胞的自我更新狀態以分化出腸上皮細胞[18]。Ten Berge 等[19]發現Wnt可以維持小鼠胚胎干細胞的多能性。因此Wnt對于退化性疾病的治療有一定臨床意義。

1.3 WNT通路抑制劑通過多種途徑作用于WNT受體

Wnt/β-catenin能受到多種因素的調節，其中有分泌型Frizzled相關蛋白（sFRPs）和Wnt抑制蛋白（WIF），兩者都能與Wnt結合從而競爭性抑制Wnt和FZD/LRP受體的結合。其他Wnt抑制劑包括Dickkopf（DKK）和WISE/SOST家族蛋白，能夠結合LRP5/6而拮抗信號通路的傳導。此外還有一種膜結合糖蛋白APCDD1能夠分別與Wnt和LRP結合從而削弱Wnt信號傳導通路。

1.4 Wnt信號通路和腫瘤

早期研究將Wnt通路與乳腺癌和結腸癌聯系起來，并證明Wnt信號通路的激活會促進腫瘤的起始和發展。隨后有研究證明最初設想過于簡單，Wnt通路在不同環境中對于腫瘤的形成起到不同的作用，不能僅用單一的機制來解釋。APC突變造成的遺傳性腫瘤病變被稱為家族性腺瘤性息肉病（FAP）。FAP患者攜帶雜合子APC基因突變，第二個等位基因在能成長為結腸腺瘤、息肉的個體細胞中經常丟失，KRAS、TP53和Smad4等其他的基因突變會誘發這些息肉的惡變。大多數散發性大腸癌源于APC等位基因的缺失，造成β-catenin和TCF家族成員TCF4復合物的形成。近期全球的全基因組外顯子測序已證實，絕大多數大腸癌患者基因組中存在APC突變[20]。此外還揭示編碼TCF4的基因VTl1A 和Tcf7l2罕見但周期性出現的融合現象，使結腸癌的癌基因列表又增添一位Wnt信號通路成員[21]。

2 Wnt/β-catenin信號通路相關因素在胰腺癌中的表達水平

Wnt信號通路多方面調節胰腺癌的生物學特性，通路活性在胰腺癌中普遍上升，胰腺癌細胞表達多種Wnt配體[22]，在大部分人類胰腺腫瘤中都發現Wnt信號通路構成因子突變。除經典的Wnt信號通路，非經典的Wnt信號通路也在胰腺癌中起到重要作用[23、24]，不同的Wnt通路的重要性還需要進一步研究。

越來越多的證據表明Wnt/β-catenin信號通路在胰腺癌中的作用隨著病程、位置、作用強度、激活機制的不同而發生改變，有時甚至會自相矛盾。β-catenin在正常胰腺發育過程中是必不可少的，但在成人胰腺中表達下調。基因測序技術證明胰腺癌有大量高度易變的基因改變，這些基因改變與Wnt信號通路等所有腫瘤共有的12條通路相關。海澤等已經證明，Wnt/β-catenin通路的上調可以誘導胰腺癌發生。Qiao等發現β-catenin參與胰腺癌的發生，其胞膜表達減弱、胞質的異位表達均與胰腺癌的預后緊密相關。相反，Lowy等研究發現β-catenin在胰腺癌細胞中表達下調而不是上調。Heiser等研究發現，在小鼠體內持續活化β-catenin可導致胰腺上皮內瘤變（PanIN）及最終腫瘤形成。Zhang Y等[25]發現抑制Wnt通路會顯著延遲胰腺上皮內瘤變的形成。3-Cl-AHPC能抑制β-catenin在胰腺癌細胞中的表達[26]。SOX15 （sex determining region Y—box 15）也能抑制Wnt/β-catenin通路，從而在胰腺癌中起到腫瘤抑制因子的作用[27]。Ripka等研究認為Wnt通路增強了胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移活性，參與胰腺癌細胞的上皮-間充質轉化（EMT）過程。調節EMT的轉錄因子ZEB1（也稱為DEF1）受到β-catenin的直接調控。在形成EMT的過程中，它不僅在多種不同類型的腫瘤中都可以穩定轉錄表達E-鈣粘蛋白（E-cad），還能激活間充質基因[28]。根據研究，經典Wnt/β-catenin通路中的各個因子在所有的胰腺癌病例中都上調，但Wnt/β-catenin信號通路拮抗劑DKK1的上調卻能促進腫瘤的侵襲，不過其機制尚未明確[29]。Wnt/β-catenin信號通路及其下游基因在胰腺癌中的具體作用還有待更全面的基因檢測以得出進一步的結論。

3 Wnt/β-catenin信號通路在胰腺癌發生和發展中的作用機制

3.1 Wnt/β-catenin信號通路對胰腺癌細胞增殖的作用機制

β-catenin是Wnt通路的調解中心，胞質中的β-catenin與TCF / LEF結合后進入細胞核成為轉錄激活劑，最終激活Wnt靶基因，如C-Myc、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、環氧合酶-2（COX-2）、c-Jun及纖連蛋白（FN）等。C-Myc是一種常見的原癌基因，可使細胞無限增殖獲永生化功能，是調控細胞周期的主要基因，與多種腫瘤發生發展有關。C-Myc表達的變化與細胞的增殖及分化狀態有關，其表達產物在調節細胞生長、分化或惡性轉化中發揮作用。目前認為胰腺癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌、宮頸癌等都有C-Myc基因的擴增或過度表達。Cyc1inDl基因又稱PARDI，是Gl期細胞增殖信號的關鍵蛋白，是細胞周期素之一。CyclinD1能與細胞周期蛋白激酶（CDK4）結合激活成CDK4一CyclinD1復合物，與多種蛋白協同作用促進細胞由G1期向s期的過渡。Schuuring等研究表明Cyclin-D1擴增和蛋白表達在多種組織的癌變早期就已出現，且與腫瘤的浸潤生長、淋巴轉移及預后差有關。COX-2能激活環磷酸腺苷（cAMP）途徑誘導腫瘤血管生成，并通過抑制機體免疫系統和改變腫瘤周圍微環境而利于腫瘤的浸潤轉移，其代謝產物前列腺素E2（PGE2）能夠刺激細胞增殖抑制凋亡。另外，COX-2高表達促使慢性炎癥部位形成癌前微環境（PCM），其具有類似腫瘤微環境（CM）的生物特性可以促使慢性炎癥向腫瘤轉變。

近期有研究發現一種新型的基因-胰腺癌促進因子（PAUF），能夠通過上調β-catenin的表達誘導胰腺細胞快速增殖，因此可推測β-catenin可能成為胰腺癌靶向治療的目的基因。激活SIRT1基因能夠在表達PAUF基因的胰腺癌細胞中下調β-catenin的表達，從而成為胰腺癌的一條治療途徑[30]。

3.2 Wnt/β-catenin信號通路對胰腺癌細胞浸潤遷移的作用機制

Wnt2是循環腫瘤細胞（CTC）的候選基因，能夠促進胰腺癌細胞的遷移，在人體中胰腺癌非貼壁腫瘤干細胞的形成與多種Wnt基因的上調有關。對galectin-3進行轉染使β-catenin下調后，胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力都受到抑制[31]。胰腺癌細胞與周圍基質環境之間的相互作用中也出現Wnt信號通路的激活。有研究表明位于上皮組織的E-cad與β-catenin結合減少的胰腺癌患者往往預后較差。Krebs yon den Lundgen-6/Mucin 1敲除后，E-cad 和E-cad/β-catenin 復合體的表達都增加， 但核中的β-catenin， cyclin D1和c-myc的表達都減少，導致胰腺癌細胞的增殖減緩、凋亡增多和侵襲能力下降[32]。定位在細胞膜上的β-catenin受到E-cad的控制以維持細胞與細胞的粘附。在正常成體細胞中，胞質內的β-catenin大部分與E-cad及α-連環蛋白（α-catenin）結合形成復合體參與細胞骨架的調節，維持同型細胞的黏附，保證上皮的完整性，防止細胞轉移，少部分游離的β-catenin在胞質內被降解復合體磷酸化后由泛素蛋白酶體識別并降解，保持胞內β-catenin血低水平狀態。Wnt通路激活后β-catenin即與E-cad分離，使β-catenin由細胞膜解離而進入胞質和胞核，導致E-cad介導的細胞黏附連接作用喪失，使腫瘤細胞脫落、分散和移動，從而形成轉移和浸潤。Wnt信號通路的另一個組成部分APC，參與極化細胞的遷移和細胞間的粘附。早期有研究表明，APC定位在遷移細胞上與成束微管相連的細胞膜突出部分。最近有研究發現APC的分布與以整合素為基礎的定向遷移粘附的信號復合體的激活相關。此外還發現與E-cad和β-catenin相關的粘合連接點上有一種APC同源體（E-APC），損傷E-APC位點會破壞細胞-細胞間的粘附，上調胞質中β-catenin的水平。Wnt信號通路異常除促進細胞增殖破壞細胞間粘附外還會促進血管內皮生長因子（VEGF）生成 ，同時上調基質金屬蛋白酶（MMP）家族的表達，增加其對細胞外基質（ECM）的降解促進腫瘤細胞轉移侵襲。CXCR4表達陽性患者的整體生存率顯著低于陰性的患者，CXCR4的缺失會顯著影響胰腺癌細胞的增殖和侵襲，Wnt靶基因如Vimentin and Slug也受到抑制。近期Criscimanna A等[33]發現缺氧能夠促進胰腺癌的增殖、遷移和侵襲，缺氧誘導因子2α在胰腺上皮內瘤變的過程中通過維持Smad4的β-catenin的適當水平調節Wnt信號通路。

Dickkopf（DKK）基因蛋白產物是Wnt的拮抗劑，能夠與Frizzled受體結合參與腫瘤的進展過程。在大部分胰腺癌細胞系中DKK-1的表達顯著上調，而DKK-3表達水平較低，DKK-2與DKK-4則未檢出。在胰腺癌細胞中敲除DKK-1導致其遷移能力下降，增殖與侵襲的能力也受到抑制。盡管DKK-1對于WNT信號通路起到拮抗作用，它在胰腺癌對周圍組織的浸潤過程中卻起到重要作用。抗DKK1抗體能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和增殖能力，能夠作為腫瘤診斷和治療的潛在工具[34]。

4 展望

胰腺癌是一種惡性程度較高的腫瘤，死亡率在所有惡性腫瘤中居第4位。隨著我國生活水平的提高和飲食結構的改變，近年來胰腺癌的發病率呈現上升趨勢并且有年輕化的傾向。有研究顯示胰腺癌患者5年生存率不超過5%，伴轉移的中位生存時間不超過6個月。胰腺癌預后極差的原因一方面在于臨床上約80%的胰腺癌患者在出現癥狀而就診時已經存在轉移，另一方面在于它對于放化療均不敏感，雖然吉西他濱對部分患者能起到一定效果，但還沒有任何一種化療方案能延長轉移性胰腺癌患者的生存中位數，因此開發新型抗胰腺癌藥物尤為重要。

胰腺癌中Wnt/β-catenin信號通路的激活和調節方式意味著臨床上胰腺癌可能更適合基因治療或Wnt/β-catenin信號通路靶向治療，β-catenin也可以作為胰腺癌預后判斷的生物標志物。最近有研究表明阻斷WNT通路配體和受體的相互作用以調制Wnt/β-catenin信號通路是一種合適的胰腺癌治療方法。許多人造的Wnt通路調節物，包括分子類、多肽類、抗體類，在多種癌癥的動物模型中表現出巨大的前景。實際上Wnt抑制劑OMP-18R5等靶向治療Wnt/β-catenin信號通路的藥物正在逐步發展到臨床運用中，但只有極少數的Wnt/β-catenin通路抑制劑進展到臨床試驗早期階段，包括IGC-001、CWP232291、??PRI-72等。除此之外，非甾體類抗炎藥可以降低β-catenin的濃度，抑制Wnt通路。Dihlmann研究證實吲哚美辛和阿司匹林都可干擾β-catenin/TCF復合物功能來發揮抑癌作用。甲磺酸伊馬替尼（格列衛）可選擇地抑制血小板衍生生長因子（PDGF）受體，下調Wnt通路關鍵蛋白β-catenin水平，并能降低Cyclin D1、TCF/LEF等下游靶基因的表達，從而發揮抗癌的作用。

胰腺癌形成的起始步驟是MAPK/ERK信號通路的激活，是上皮內瘤變的關鍵步驟[35]。突變的Kras和Wnt通路協同推進其他組織的腫瘤發生，例如肺和結腸[36]。近期還發現黑色素瘤和結腸癌中都存在MAPK和Wnt通路的上位相互作用[37、38]，在黑色素瘤中Wnt抑制MAPK，而在結腸癌中Wnt穩定Ras從而提高MAPK的活性。大部分腫瘤中存在多通路的共同作用，鑒于Wnt與其他致瘤和抑瘤通路的相互作用，未來的研究不僅要能夠將Wnt通路抑制劑應用到臨床上，還應致力于進一步解決Wnt與其余信號通路網絡之間相互串擾的機制問題。盡管未來充滿挑戰，Wnt/β-catenin信號通路的靶向治療仍是一種很有前景的腫瘤治療方法。

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