氯芐基砜衍生物含量測定方法學研究

陳莉?楊建云等

摘 要 目的 建立氯芐基砜衍生物（CBS）含量測定高效液相色譜法，并進行方法學研究，驗證方法的可靠性及科學性；方法 色譜柱為Phenomenex LUNA C18 250×4.6mm 5μm；流動相為乙腈- 0.1%三氟乙酸（45：55，V/V）；流速1.0 mL.min-1；檢測波長279 nm；柱溫40 ℃；進樣體積20 μL；結果 精密度RSD為0.6%，線性范圍為10 μg·mL-1～100 μg·mL-1 （r2=0.9990），CBS平均含量為100.91%（n=6），有關物質與主峰分離良好。結論 該方法簡便、靈敏、準確，可用于CBS的質量控制。

關鍵詞 氯芐基砜衍生物 方法學研究 高效液相色譜法

輻射對正常人體細胞的損傷早在1896年就為公眾所知，其對細胞和組織的作用是一個復雜的現象。近年來受各種因素影響，人們受輻射幾率有所提高[1]，在一些特殊診斷、治療過程中，不可避免地會受到不同程度的輻射[2]。氯芐基砜衍生物（CBS）為一種新型的具有DNA修復功能的化合物[3]。其已被證明，在受到輻射照射時可發揮保護作用[4]。然而，目前沒有高效液相色譜法[5]可用于分析此化合物。本文旨在建立和驗證，CBS的高效液相色譜分析；采用液相色譜分析在酸性，堿性及氧化條件下CBS的降解產物[6]；應用此方法，評估CBS固態藥物穩定性，研究其質量控制方法。

1 儀器與試藥

Waters Alliance 2996/2695高效液相色譜儀（美國）；BP211D型電子天平（德國SARTORIUS）；UV2510紫外可見分光光度計（日本島津）。CBS對照品（批號20111103，純度99.96%）CBS供試品（自制，批號：20110916，20110929，20111021）均由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所提供。乙腈（色譜純）購自山東禹王實業有限公司；三氟乙酸（色譜純），水為純化水（哇哈哈有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Phenomenex C18 （250×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%三氟乙酸（45：55，V/V）；檢測波長：279 nm；流速：1.0 ml/min；進樣體積：20 ?L；柱溫：40 ℃。在該色譜條件下，理論板數按CBS峰計算不低于10000，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 CBS色譜圖（保留時間在11.9min，雜質峰21.3min）

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液配制 精密稱取對照品10 mg于100 mL量瓶中，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）溶解并制成每1 mL約含CBS0.1 mg的溶液，作為對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液配制 精密稱取樣品10 mg，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）溶解并制成每1 mL約含CBS0.05 mg的溶液，作為供試品溶液備用。

2.3 專屬性考察

2.3.1 酸降解物 取CBS樣品配制得1 mg/mL貯備液。精密量取貯備液1 mL于10 mL量瓶中，加1.0 mol.L-1鹽酸3 mL，80 ℃水浴加熱5.5小時，加1.0 mol.L-1氫氧化鈉3 mL調至中性，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，進樣20 ?L，記錄色譜圖2（a）。

2.3.2 堿降解物 取CBS樣品配制得1 mg.mL-1貯備液。精密量取貯備液1 mL于10 ml量瓶中，加1.0 mol.L-1氫氧化鈉3 mL，80℃水浴加熱5.5小時，加1.0 mol.L-1鹽酸3 mL調至中性，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，進樣20 ?L，記錄色譜圖2（b）。

2.3.3 氧化產物 取CBS樣品配制得1 mg.mL-1貯備液。精密量取貯備液1 mL于10 mL量瓶中，加30%雙氧水3 mL，80℃水浴加熱5.5小時，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，進樣20 ?L，記錄色譜圖2（c）。

2.3.4 光降解物 取CBS樣品在4500 xl光照條件下放置10天后，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）配制得100 μg.mL-1溶液，進樣20 ?L，記錄色譜圖2（d）。

2.4 線性范圍的考察

分別精密量取“2.2項下”對照品貯備液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、8.0 mL，置10 mL量瓶，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）稀釋至刻度，分別配制成10、20、40、50、60、80 μg.mL-1的梯度對照品溶液，取上述溶液及貯備液20 μL，在“2.1”色譜條件項下分別2次進樣。以對照品進樣濃度（X，μg.mL-1）為橫坐標，以對照品峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，結果表明CBS在10 μg.mL-1～100 μg.mL-1的范圍內具有良好線性關系。回歸方程為Y=10018X+54521，r2=0.9990（n=7）。

2.5 檢測限與定量限的確定

以信噪比3：1時注入儀器的量為檢測限，以信噪比約為10：1時注入儀器的量為定量限。結果CBS的檢測限為1.2 ng，定量限為4.0 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.4”項下濃度為50 μg.mL-1的對照品溶液，按上述色譜條件連續進樣6次，其色譜峰面積的RSD為0.6%。結果表明測定時儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取同一批的LF原料藥按“2.2”項下方法制備濃度為40 μg.mL-1、50 μg.mL-1和60 μg.mL-1的高中低3個濃度的標準溶液，每個濃度平行配制3份，共9份，在“2.1”色譜條件項下分別進樣測定，平均含量為100.91%，RSD為0.93%，表明本法的重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取室溫下放置的高、中、低3個濃度的供試品溶液，在0，4，8，12，24，48，72 h分別進樣20 μL，測定峰面積，計算高、中、低3個濃度的峰面積的RSD分別為1.3%、1.5%及0.43%。表明供試品溶液在室溫放置72h內穩定性良好。

2.9 有關物質

取樣品10 mg，加不加酸流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含0.1 mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液；精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照含量測定項下的方法試驗，精密量取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調節儀器靈敏度，使對照溶液中主成分峰的峰高約為記錄儀滿量程的10%-30%；再取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍，供試品溶液的色譜圖中如有雜質峰，用各有關物質峰面積與對照溶液主成分峰面積（1%）做比較，計算有關物質的量，單個雜質不得大于1.0%，總雜質不得高于1.5%，結果見表1。

3 含量測定

精密量取供試品儲備液5 mL置10 mL量瓶中，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）稀釋至刻度，搖勻，得到50 μg.mL-1的樣品溶液。精密量取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。另取對照品儲備液5 mL置10 mL量瓶中，加不加酸流動相（乙腈：水=45：55）稀釋至刻度，搖勻，得到50 μg.mL-1的對照品溶液，依“2.1項下”色譜條件測定。按外標法以峰面積計算其含量，結果見表1。

4 討論

4.1 波長選擇

采用全波長對樣品進行測定，通過考察各成分的分離情況及各色譜峰的豐度，最后選定檢測波長為279 nm。

4.2 流動相確定

比較3種流動相系統及其不同的流動相比例，包括乙腈：0.1%三氟乙酸、甲醇：0.1%三氟乙酸、乙腈：醋酸水溶液，比較的醋酸濃度有0.1%，0.05%醋酸水溶液；乙腈：0.1%三氟乙酸系統考察等度及梯度系統。結果表明，各種流動相中以乙腈：0.1%三氟乙酸系統最佳，其圖譜上各個色譜峰的分離度較好，保留時間適中，因此選擇此流動相系統作為樣品HPLC檢測的流動相。

4.3 色譜柱考察

選擇不同填料、規格及廠家的色譜柱進行比較，包括Phenomenex LUNA C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）、Agilent Zorbax C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）。結果表明，各種色譜柱中以Phenomenex LUNA C18 Colum最佳，所得色譜圖分離度良好，柱效較高，因此選擇此色譜柱作為樣品HPLC檢測色譜柱。按本文的色譜條件對樣品進行測定，樣品均能與其他成分很好的分離，測得理論板數、分離度及對稱因子，結果見表2。

4.4 其他

比較不同柱溫與流速，柱溫升高，分析時間縮短，峰型改善；流速低于1.0 ml.min-1分析時間延長，高于1.0 ml.min-1分析時間縮短。因此選擇柱溫40 ℃與流速1.0 ml.min-1。

綜上所述，經過試驗確定了CBS的HPLC分析方法，同時測定了3批次該原料藥。上述方法準確、穩定，操作簡單易于實施，可用于CBS的質量控制。

參考文獻

[1] 許愛琴，孫玉文，馮全生，等.現代中醫防輻射研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2010，19（30）：3361-3363.

[2] 楊鎮州.抗輻射藥物研究進展[J].重慶藥學，2004，33（3）：467-469.

[3] Mihel BD，et al Mechims of DNA Damagese Repair.Academic， 1986： 325-328.

[4] Nenot JC.Radiation accidents over the last 60 years.Radiol Prot 2009， 29：301-320.

[5] 國家藥典委員會.中國藥典[M].第二部.北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[6] 姜建國，張西如，高燕霞，等.反相高效液相色譜法測定洛伐他汀有關物質.[J]藥物分析雜志，2009，29（11）：1956-1960.