水稻丙二烯氧化物合成酶基因OsAOS1的表達(dá)研究

摘要：茉莉酸（Jasmonate， JA）為植物病蟲害抗性反應(yīng)中重要的信號(hào)分子，茉莉酸類物質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶為丙二烯氧化物合成酶（Allene oxide synthase， AOS）。已知水稻AOS基因家族包括4個(gè)成員，OsAOS1～OsAOS4。已有研究表明，水稻OsAOS2基因的過量表達(dá)提高了內(nèi)源PR1基因的表達(dá)、增強(qiáng)了水稻對稻瘟病的抗性。本研究分析了OsAOS1基因表達(dá)的組織和器官特異性以及外源JA處理對OsAOS1基因表達(dá)的影響，同時(shí)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究了OsAOS1基因在調(diào)控內(nèi)源PR1基因表達(dá)中的作用。研究結(jié)果表明：OsAOS1基因表達(dá)的組織和器官特異性不同于OsAOS2基因；外源JA處理誘導(dǎo)OsAOS1基因的瞬時(shí)表達(dá)，然而OsAOS2基因的誘導(dǎo)表達(dá)延遲； OsAOS1過量表達(dá)抑制煙草中內(nèi)源PR1基因的表達(dá)。據(jù)此推測OsAOS1基因可能不參與依賴于PR1的抗病反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：水稻； 茉莉酸； 丙二烯氧化物合成酶； 轉(zhuǎn)基因； PR1基因

中圖分類號(hào)：Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）05-0001-05

最早從真菌Lasiodiplodia theobromae培養(yǎng)液中分離得到茉莉酸（Jasmonate， JA）[1]，后來的研究表明JA在植物的生長發(fā)育以及抗性方面均具有重要作用，例如JA在種子的萌發(fā)、根的生長、植物的育性和衰老等重要的生理過程中起作用[2～7]。近幾年來，越來越多的研究表明JA作為一種防衛(wèi)信號(hào)分子起作用，參與雙子葉植物病蟲害抗性反應(yīng)[8～11]。

雖然JA在單子葉植物抗性反應(yīng)中的功能遠(yuǎn)不如雙子葉植物中了解的清楚，但是仍有一些證據(jù)間接表明了JA在水稻抗病反應(yīng)中具有重要作用。外源JA處理能夠誘導(dǎo)水稻PR1基因（PR1a和PR1b）的表達(dá)[12～14]。JA生物合成抑制劑處理水稻能夠降低內(nèi)源JA的含量，同時(shí)也降低了病原菌誘導(dǎo)的PR1蛋白的積累水平[15]。

JA的生物合成途徑也稱類十八烷生物合成途徑：亞麻酸經(jīng)脂氧合酶（Lipoxygenase， LOX）催化合成13（S）-氫過氧化亞麻酸（13-hydroperoxylinolenic， 13-HPOT），13-HPOT在丙二烯氧化物合成酶（Allene Oxide Synthase， AOS）、丙二烯氧化物環(huán)化酶（Allene Oxide Cyclase， AOC）等酶類的催化下生成10，11-二氫-12-氧植物二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid， OPDA）[16]。OPDA再經(jīng)過三次β氧化后生成JA[17]，另外，JA還可以被廣泛地修飾。

可見，AOS是JA生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。亞麻（Linum usitatissimum）AOS基因在馬鈴薯中過量表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株中JA含量[18]；而擬南芥AOS基因的過量表達(dá)卻不能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草中JA水平，除非受到機(jī)械損傷誘導(dǎo)[19]。水稻基因組中含有4個(gè)AOS基因[20，21]。其中，OsAOS1基因編碼的產(chǎn)物具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其表達(dá)受傷處理快速瞬時(shí)誘導(dǎo)，這種結(jié)構(gòu)特征以及表達(dá)特征都與雙子葉植物AOS基因相似，而不同于單子葉植物中AOS基因。Mei等（2006）[24]的報(bào)道表明，水稻OsAOS2基因過量表達(dá)能夠提高水稻內(nèi)源JA含量、誘導(dǎo)PR基因表達(dá)以及增強(qiáng)對稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的抗性[22]。為了研究OsAOS1在水稻生長發(fā)育中的作用，我們分析了OsAOS1基因表達(dá)的器官特異性、對外源JA處理應(yīng)答反應(yīng)。此外，我們還構(gòu)建了OsAOS1基因的過量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，為進(jìn)一步研究OsAOS1基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11植物材料

試驗(yàn)中所用的水稻材料為日本晴品種（Oryza sativa L cv Nipponbare），所用煙草材料為SR品種（Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR）。

12植物材料的培育

日本晴水稻種子表面消毒后，播種于04%（W/V）的瓊脂培養(yǎng)基中，在光照培養(yǎng)箱（寧波江南）中培養(yǎng)7天，然后移栽至溫室土壤中（白天，28℃/夜晚，23℃）繼續(xù)培養(yǎng)至六葉一心期。

13OsAOS基因表達(dá)的器官特異性分析

日本晴水稻在溫室中長至六葉一心期時(shí)，從土壤中拔出，把根部清洗干凈。分別取根部（10個(gè)植株）、莖部（20個(gè)植株）、葉片（3個(gè)植株），液氮中速凍，然后置于-70℃低溫冰箱中保存，用于2個(gè)AOS基因的表達(dá)分析。莖部取材時(shí)盡量去除葉子；葉片為第六葉。

14外源JA處理

茉莉酸（購于Sigma公司）溶于甲醇，配成100 mmol/L的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用滅菌蒸餾水稀釋為100 μmol/L的工作液。Mock處理使用1‰的甲醇水溶液。分別利用上述溶液噴灑六葉一心期野生型水稻，直至葉片有水珠滴落為止，分別在0、2、6、24和48 h時(shí)取第六片葉，在液氮中速凍，然后置于-70℃低溫冰箱中保存，用于AOS基因表達(dá)水平分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)植株葉片混合物作為樣品。

15OsAOS1基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)OsAOS1（AK068620）基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)PCR引物對：fFw：5′TAGGTCTAGATCATCGGATCAAGGG3′/fRv：5′GACTCGAGGGCGCCGGAGACTTTG3′（其中下劃線序列分別是Xba Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列），利用TaKaRa高保真酶（PrimerSTAT HS DNA Polymerase）從水稻基因組中擴(kuò)增OsAOS1基因，克隆到pMD18-T載體（TaKaRa），篩選陽性克隆，并通過測序確認(rèn)核苷酸序列的正確性。通過Xba Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切將OsAOS1基因克隆到雙元表達(dá)載體pPZP2Ha3 （+）的35S啟動(dòng)子（P35S）和Tnos之間，構(gòu)建35S∶OsAOS1表達(dá)載體。

16煙草轉(zhuǎn)化

將上述OsAOS1基因表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105[22]。采用葉盤法[23]轉(zhuǎn)化煙草。

17OsAOS1基因和PR1基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況

在轉(zhuǎn)基因煙草種子成熟階段取上部幼嫩葉片，液氮凍存。用于分析OsAOS1、NtPR1a和NtPRB1b的表達(dá)情況。

18RNA分析

RNA的提取按照TaKaRa RNAisoTM plus（TaKaRa）說明書進(jìn)行操作，利用RNase-free DNase Ⅰ（TaKaRa）除去RNA中的DNA，按EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書（全式金）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本研究中所用引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，所擴(kuò)增基因在GenBank/EMBL 數(shù)據(jù)庫中的序列號(hào)和PCR擴(kuò)增條件如表1所示。利用20%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。利用Gel-Pro Analyzer 40 software （Media Cybernetics， USA）分析PCR條帶的信號(hào)強(qiáng)度，并計(jì)算目的基因與內(nèi)標(biāo)基因（OsActin、OsUBQ和NtActin基因）的相對值。

2結(jié)果與分析

21OsAOS1和OsAOS2基因在水稻不同器官中的表達(dá)

通過比較2個(gè)水稻AOS基因在根、莖和葉片中的表達(dá)水平，可以看出OsAOS1和OsAOS2基因表達(dá)的器官特異性相似，但這兩個(gè)基因相對表達(dá)量差距較大。OsAOS1和OsAOS2基因在根、莖和葉片中的表達(dá)都依次降低，OsAOS1基因在這些器官中的相對表達(dá)量差異比較小，而OsAOS2基因在這些器官中的相對表達(dá)量差異較大（圖1）。據(jù)此推測，OsAOS1基因在水稻生長發(fā)育中的作用可能不同于OsAOS2基因。

A：利用RT-PCR分析OsAOS1和OsAOS2基因在水稻根、莖和葉子中的轉(zhuǎn)錄本水平；B：OsAOS1和OsAOS2基因相對OsActin的表達(dá)分析

圖1OsAOS基因在六葉期水稻植株不同器官中的表達(dá)

22外源JA對OsAOS1基因和OsAOS2基因表達(dá)的影響

外源JA處理2 h，葉片中OsAOS1基因的表達(dá)被明顯誘導(dǎo)，隨后OsAOS1基因的表達(dá)逐漸降低。而OsAOS2基因的誘導(dǎo)表達(dá)出現(xiàn)在JA處理后24 h，然后持續(xù)表達(dá)（圖2）。這個(gè)結(jié)果表明，OsAOS1和OsAOS2基因都參與了JA依賴的反應(yīng)，但是反應(yīng)機(jī)制不同。值得注意的是Mock處理對OsAOS2的表達(dá)有一定的影響，這可能是由于噴灑甲醇溶液時(shí)，氣流對葉子產(chǎn)生一種機(jī)械作用所導(dǎo)致，而OsAOS1基因可能不參與該途徑。

A：利用RT-PCR分析外源JA處理后不同時(shí)間點(diǎn)OsAOS1和OsAOS2基因的表達(dá)水平；B：OsAOS1基因和OsAOS2基因相對OsUBQ的表達(dá)分析

圖2外源JA處理對水稻葉片OsAOS1基因和

OsAOS2基因表達(dá)水平的影響

23OsAOS1轉(zhuǎn)基因煙草抑制NtPR1基因的基礎(chǔ)表達(dá)

已有研究表明，煙草的NtPR1a和NtPRB1b與煙草的抗病性直接相關(guān)[25，26]。因此，我們構(gòu)建了OsAOS1基因的過量表達(dá)載體（圖3A），轉(zhuǎn)化至煙草中，分析了T2代轉(zhuǎn)基因煙草中OsAOS1基因的表達(dá)水平與NtPR1a基因和NtPRB1b基因的表達(dá)水平之間的關(guān)系。如圖3B和3C所示，轉(zhuǎn)基因煙草不同株系中OsAOS1基因的表達(dá)水平均高于非轉(zhuǎn)基因煙草。與此相反，NtPR1a和NtPRB1b的表達(dá)水平明顯低于非轉(zhuǎn)基因煙草植株。這些結(jié)果表明OsAOS1基因在煙草中的過量表達(dá)抑制了煙草PR1基因的表達(dá)。

注：15-2、19-2、20-3和22-1是4個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因煙草株系， SR是野生型煙草。

A：轉(zhuǎn)OsAOS1基因表達(dá)載體示意圖；B：利用RT-PCR分析OsAOS1轉(zhuǎn)基因煙草中OsAOS1和NtPR1基因的表達(dá)情況；C：OsAOS1和NtPR1基因相對于NtActin的表達(dá)分析

圖3轉(zhuǎn)基因煙草中OsAOS1的過量表達(dá)抑制NtPR1基因的表達(dá)水平

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，OsAOS1和OsAOS2基因表達(dá)的器官特異性和對外源JA處理的應(yīng)答反應(yīng)均不同。此外，有報(bào)道表明傷處理誘導(dǎo)OsAOS1基因快速瞬時(shí)表達(dá)[21]，而OsAOS2基因不受傷處理的誘導(dǎo)[24]。Haga和Iino（2004）構(gòu)建的AOS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示OsAOS1在進(jìn)化樹上的位置相對其他單子葉AOS蛋白更接近于雙子葉植物AOS[21]。這些表達(dá)和結(jié)構(gòu)上的不同可能決定了OsAOS1和OsAOS2功能上的差異。

OsAOS2基因過量表達(dá)激活了JA應(yīng)答的OsPR1a和OsPR1b的表達(dá)[22]。然而在OsAOS1基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草，內(nèi)源PR1基因的表達(dá)均被抑制。通過對轉(zhuǎn)基因煙草中PR1基因的表達(dá)情況分析，我們推斷OsAOS1基因可能是負(fù)調(diào)控JA應(yīng)答反應(yīng)中PR1基因的表達(dá)。我們做了如下假設(shè)：在轉(zhuǎn)基因煙草中，外源AOS基因和內(nèi)源AOS基因的底物相同，當(dāng)OsAOS1基因過表達(dá)后，通過該條途徑的JA反應(yīng)會(huì)明顯增強(qiáng)，OsAOS1調(diào)控的JA反應(yīng)可能不直接影響PR1基因的表達(dá)。但是如此一來，因?yàn)榈孜锏南拗疲ㄟ^煙草內(nèi)源的、與PR1基因表達(dá)相關(guān)的AOS基因所調(diào)控的JA反應(yīng)就會(huì)減弱，導(dǎo)致煙草內(nèi)源PR1基因的表達(dá)降低。我們需要更多直接證據(jù)來驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)。

此外，外源JA、SA和稻瘟病能夠誘導(dǎo)水稻PR1a和PR1b基因的表達(dá)，所以 PR1a和PR1b基因被認(rèn)為與水稻抗病反應(yīng)相關(guān)[27，28]。OsAOS1基因的過量表達(dá)抑制了NtPR1a和NtPRB1b基因的表達(dá)，因此OsAOS1基因可能不參與水稻抗病反應(yīng)。Haga 和 Iino （2004）的研究表明，OsAOS1基因參與調(diào)控光敏色素介導(dǎo)的水稻胚芽鞘延伸，因?yàn)樵贠sAOS1基因缺失的突變體cpm1中，光敏色素介導(dǎo)的胚芽鞘生長抑制現(xiàn)象明顯小于野生型[21]。OsAOS1基因在水稻生長發(fā)育中的其它作用，還需要我們進(jìn)一步分析AOS1轉(zhuǎn)基因水稻和煙草植株的生理、生化特征及對各種生物脅迫和非生物脅迫的反應(yīng)。

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