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洋蔥ANS基因啟動子的克隆與瞬時表達分析

2013-04-29 00:00:00劉暢等
山東農業科學 2013年5期

摘要:通過PCR方法對洋蔥花青素合成酶基因(AcANS)上游啟動子序列進行擴增,獲得長度為18 kb和22 kb的兩種片段,命名為ANSPM1和ANSPM2。序列分析表明,克隆到的兩個啟動子除含有多個TATA-box、CAAT-box等基本啟動子元件,還含有與MYB轉錄因子結合的元件,以及參與光響應、逆境、激素應答的順式作用元件。同時構建ANSPM1和ANSPM2驅動GUS報告基因的植物表達載體,通過洋蔥表皮細胞瞬時表達分析,表明兩個啟動子均有活性。

關鍵詞:洋蔥;花青素合成酶基因(ANS);啟動子;克隆;瞬時表達

中圖分類號:Q785;Q786文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2013)05-0013-05

洋蔥(Allium cepa L)又稱球蔥、圓蔥、玉蔥、蔥頭,二年生草本植物,百合科蔥屬,是人們喜食的蔬菜。近些年人們更多地將洋蔥作為一種保健食品,因為洋蔥是富含類黃酮物質的蔬菜之一。

類黃酮是高等植物水溶性次生代謝產物,主要包括6類化合物:查爾酮、黃酮、黃烷雙醇、黃酮醇、花青素和原花色素[1]。已有研究指出,類黃酮具有抗氧化[2]、降低心血管疾病及癌癥風險的功能[3]。

花青素是一類重要的水溶性天然植物色素,屬于類黃酮物質,在植物體中廣泛分布。作為一種天然的食用色素,安全、無毒、資源豐富,而且具有重要的營養和藥理作用[4]。自然條件下游離的花青素極少見,常與一個或多個葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色素苷。花青素合成酶(ANS)是位于花色素苷合成通路末端的酶,催化無色花色素向花色素的轉化[5]。自1990年Messen等利用轉座子標簽技術從玉米中分離了ANS基因后,學者們又先后在美國金鐘連翹(Forsythia×intermedia )[6]、紫蘇(Perilla frutescens)[7]、蕪菁(Brassica campestris L ssprapa)[8]、紫菜薹(Brassica campestris var purpuraria)[9]、紫苤藍(Brassica oleracea varcaulorapa)[10]等植物中克隆了ANS基因,本課題組對AcANS基因進行了克隆和序列分析[11],本研究即在此基礎上展開。

高等植物基因的表達調控是分子生物學研究領域的熱點,啟動子是基因表達調控的重要組成部分。深入研究啟動子的結構和功能,可利用基因工程技術對植物轉基因表達進行調控。為探索洋蔥ANS基因在轉錄水平上的表達調控機制,本實驗克隆了洋蔥ANS基因啟動子并對其調控元件、結構及功能進行分析。

1材料與方法

11植物材料與菌種

洋蔥材料、野生型擬南芥種子由本實驗室提供。洋蔥鱗莖采自山東省農業科學院蔬菜研究所試驗基地,取樣后迅速用液氮速凍后于-80℃保存,用于洋蔥基因組DNA的提取。

大腸桿菌(Ecoli)菌株TOP10購自天根生化科技(北京)有限公司。根癌農桿菌LBA4404菌株及植物雙元表達載體pBI121由本實驗室提供。

12試驗試劑

Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶HindⅢ、BamHⅠ、DNA Marker DL2000均購自TaKaRa公司。其余試劑均為進口或國產分析純。引物由博尚生物技術有限公司合成,見表1。測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

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