洋蔥ANS基因啟動子的克隆與瞬時表達(dá)分析

摘要：通過PCR方法對洋蔥花青素合成酶基因（AcANS）上游啟動子序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長度為18 kb和22 kb的兩種片段，命名為ANSPM1和ANSPM2。序列分析表明，克隆到的兩個啟動子除含有多個TATA-box、CAAT-box等基本啟動子元件，還含有與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元件，以及參與光響應(yīng)、逆境、激素應(yīng)答的順式作用元件。同時構(gòu)建ANSPM1和ANSPM2驅(qū)動GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，通過洋蔥表皮細(xì)胞瞬時表達(dá)分析，表明兩個啟動子均有活性。

關(guān)鍵詞：洋蔥；花青素合成酶基因（ANS）；啟動子；克隆；瞬時表達(dá)

中圖分類號：Q785；Q786文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0013-05

洋蔥（Allium cepa L）又稱球蔥、圓蔥、玉蔥、蔥頭，二年生草本植物，百合科蔥屬，是人們喜食的蔬菜。近些年人們更多地將洋蔥作為一種保健食品，因?yàn)檠笫[是富含類黃酮物質(zhì)的蔬菜之一。

類黃酮是高等植物水溶性次生代謝產(chǎn)物，主要包括6類化合物：查爾酮、黃酮、黃烷雙醇、黃酮醇、花青素和原花色素[1]。已有研究指出，類黃酮具有抗氧化[2]、降低心血管疾病及癌癥風(fēng)險(xiǎn)的功能[3]。

花青素是一類重要的水溶性天然植物色素，屬于類黃酮物質(zhì)，在植物體中廣泛分布。作為一種天然的食用色素，安全、無毒、資源豐富，而且具有重要的營養(yǎng)和藥理作用[4]。自然條件下游離的花青素極少見，常與一個或多個葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色素苷。花青素合成酶（ANS）是位于花色素苷合成通路末端的酶，催化無色花色素向花色素的轉(zhuǎn)化[5]。自1990年Messen等利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米中分離了ANS基因后，學(xué)者們又先后在美國金鐘連翹（Forsythia×intermedia ）[6]、紫蘇（Perilla frutescens）[7]、蕪菁（Brassica campestris L ssprapa）[8]、紫菜薹（Brassica campestris var purpuraria）[9]、紫苤藍(lán)（Brassica oleracea varcaulorapa）[10]等植物中克隆了ANS基因，本課題組對AcANS基因進(jìn)行了克隆和序列分析[11]，本研究即在此基礎(chǔ)上展開。

高等植物基因的表達(dá)調(diào)控是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要組成部分。深入研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能，可利用基因工程技術(shù)對植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。為探索洋蔥ANS基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)克隆了洋蔥ANS基因啟動子并對其調(diào)控元件、結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分析。

1材料與方法

11植物材料與菌種

洋蔥材料、野生型擬南芥種子由本實(shí)驗(yàn)室提供。洋蔥鱗莖采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)基地，取樣后迅速用液氮速凍后于-80℃保存，用于洋蔥基因組DNA的提取。

大腸桿菌（Ecoli）菌株TOP10購自天根生化科技（北京）有限公司。根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株及植物雙元表達(dá)載體pBI121由本實(shí)驗(yàn)室提供。

12試驗(yàn)試劑

Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、DNA Marker DL2000均購自TaKaRa公司。其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。引物由博尚生物技術(shù)有限公司合成，見表1。測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。