RNAi介導抗水稻條紋病毒轉基因水稻的培育

摘要：本研究根據RNA干擾的機制原理，利用已構建的包含SP基因部分片段反向重復序列和生物安全性更高的標記基因bar基因的RNAi雙元表達載體pDTRSV-IRSP-Bar，通過采用農桿菌介導的方法轉化水稻愈傷組織獲得抗條紋葉枯病和抗除草劑的轉基因水稻植株，通過Basta抗性篩選、PCR檢測及Northern blot分析，獲得了穩定高抗RSV和抗Basta的株系KRSV1和KRSV9，并對其田間抗性及農藝性狀表現進行了調查研究。

關鍵詞：水稻條紋病毒；RNA干擾；反向重復序列；農桿菌介導

中圖分類號：S511.2+23.53文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）05-0038-04

水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）是纖細病毒屬（Tenuivirus）的代表成員，由介體灰飛虱以持久性方式經卵傳播，該病毒引起的水稻條紋葉枯病具有分布范圍廣、危害極嚴重的特性。在水稻條紋葉枯病流行暴發年份，能造成水稻大面積減產甚至絕收，化學防治對其效果不明顯，并且造成環境污染。因此，選育抗病品種是防治水稻條紋葉枯病的最經濟有效的方法。

RSV是一種特殊的多組分RNA病毒，其中日本T分離物全基因組序列已被測定，全長為17 145 nts， 由4條單鏈RNA組成，按照分子量由大到小分別命名為RNA1～RNA4[1～3]。RSV具有獨特的基因組結構和編碼策略，除RNA1采用負鏈編碼策略，vcRNA1編碼依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRP）外，RNA2、RNA3、RNA4均采取雙義編碼策略，其中確定與病毒致病力和侵染過程密切相關的是RSV vcRNA3編碼的病毒外殼蛋白（coat protein， CP）和vRNA4編碼的病害特異性蛋白（specific protein，SP）[4～6]。

目前抗RSV品種的培育主要是通過常規育種結合分子標記輔助選擇，但存在抗性資源缺乏、育種周期長、效率低等問題。隨著近年來RNA干擾（RNA interference， RNAi）機制研究的不斷深入，利用RNAi的高效性和特異性來控制植物的病毒病已開始得到重視和應用[7]。生物學研究表明，RNAi是由內源性或外源性雙鏈RNA （dsRNA） 所導致的細胞內特異性的基因沉默的現象，主要借助轉錄后的加工特異性地降解靶標RNA而使基因失活，從而獲得對病毒的抗性，所以也稱為轉錄后基因沉默（Post-transcription gene silencing， PTGS）[7，8] 。dsRNA的形成存在多種可能的途徑[9]，但許多研究表明，在植物體內產生dsRNA的最佳方法是轉化具有發夾結構 RNA（hairpin RNA， hpRNA）的外源基因。具有發夾結構的外源基因由兩段反向重復（Inverted repeat， IR）DNA序列和一段其他DNA（spacer）序列組成，兩段IR DNA由spacer連接起來，這樣的結構所轉錄的RNA會形成hpRNA。基于hpRNA表達而誘導的基因沉默已在多種生物、基因上獲得成功[10～13]。因此通過體外構建hpRNA可以高效地誘發基因沉默。

本研究利用已構建的包含SP基因部分片段反向重復序列和bar基因的RNAi雙元表達載體pDTRSV-IRSP-Bar，通過采用農桿菌介導的方法轉化水稻愈傷組織獲得抗條紋葉枯病和抗除草劑的轉基因水稻植株，經Basta抗性篩選、PCR檢測及Northern blot分析，獲得了高抗RSV和抗Basta的水稻植株，為水稻抗RSV品種的培育奠定了基礎。

1材料與方法