有氧運動對衰老大鼠心肌保護作用的機制研究

黃 偉

(鄭州大學體育學院，河南鄭州 450044)

心肌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)由膠原、糖蛋白和蛋白聚糖構成，其中膠原含量最為豐富(主要是I型和III型膠原)，其功能主要是:為肌細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞提供支持，傳導肌細胞內(nèi)外的機械應力，保證心肌的彈性和順應性，介導信號轉(zhuǎn)導通路［1］。伴隨著衰老的進程，心肌ECM過度沉積導致心肌纖維化，即機械性重塑和結構性重塑，主要表現(xiàn)為室壁張力增加、彈性下降、心臟充盈期縮短，心臟負荷增大造成心肌肥大而虛弱、心臟功能進行性下降，射血分數(shù)減少并易于發(fā)生心律失常和心衰［2］。據(jù)報道，衰老時I型膠原含量增加2～3倍，主要與膠原降解減少、合成增加以及成纖維細胞增殖有關［2］。

膠原降解和組織重塑是由一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶家族——基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)催化介導的。迄今為止發(fā)現(xiàn)20多種MMPs，心肌主要表達 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9 和MMP-14［3］。MMPs 以無活性的前體(酶原)(Pro-MMPs)形式由心肌細胞分泌，活化后轉(zhuǎn)變?yōu)镸MPs(active MMPs，本文中的MMPs即指活性MMPs)，降解膠原，從而破壞ECM［3］。MMPs活性主要由內(nèi)源性的組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)調(diào)節(jié)［3］。已有的研究表明，MMPs和 TIMPs功能失調(diào)是各種生理病理過程中(衰老、心衰等)心肌重塑的重要原因［4-5］。心衰時TIMPs顯著增高，與上游的調(diào)控信號轉(zhuǎn)化生長因子 -β(transforming growth factor-β，TGF-β)和氧化應激有關［6］。

體力活動減少可使心搏出量和心輸出量下降，患心臟病的風險增加，加速心臟衰老(cardiac aging)。規(guī)律活動特別是有氧運動可通過增加搏出量和心輸出量而有效改善各年齡人群的心功能［7］。此外，有研究顯示［8］，運動可減少由于增齡造成的心臟膠原積累并與心功能改善有關聯(lián)，但具體的分子機理尚不清楚。本研究以衰老大鼠為實驗模型，利用10周跑臺運動，目的在于:1)利用病理組織學方法觀察衰老大鼠規(guī)律運動后心肌膠原纖維的形態(tài)學變化;2)利用分子生物學的方法探討TGF-β/TIMP-1/MMPs信號通路是否參與了運動對衰老大鼠心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與取材

本研究于2010年4月購進3月齡健康雄性SPF級SD大鼠(購自河南大學醫(yī)學院實驗動物中心)30只后，隨即選取10只為青年對照組(young control group，YC組)，飼養(yǎng)3天后，稱量體重，用戊巴比妥鈉120 mg/kg麻醉大鼠測定血流動力學參數(shù)，然后取出心臟，迅速轉(zhuǎn)入液氮中并于﹣80℃低溫冰箱凍存待測。其余20只飼養(yǎng)至2012年1月(20月齡)制作衰老動物模型，將其隨機分為衰老對照組(old control group，OC組，n=10)和衰老運動組(old exercise group，OE組，n=10)。OE組進行10周跑臺運動，運動方案如下:1周適應性跑臺運動(坡度:0°，速度:5m/min，時間:10 min/天)后進行9周正式運動(坡度:12°，速度:10.5 m/min，時間:45 min/天，頻率:5 次/周);OC組處于安靜狀態(tài)10周。末次實驗48 h后麻醉大鼠測定血流動力學參數(shù)并取出心臟凍存待測。本實驗在河南省體育科學研究所重點實驗室完成。

1.2 血流動力學參數(shù)測定

PE-50心導管于右側(cè)頸總動脈逆行插管至左心室，另一端接壓力換能器輸入多媒體生物信號采集、處理系統(tǒng)，記錄左心室收縮期壓力(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室壓力最大上升速率(maximaldevelopingrateofleftventricular pressure，+dp/dtmax)和左室壓力最大下降速率(maximal descending rate of left ventricular pressure，-dp/dtmax)。

1.3 心肌膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)測定

取心臟組織切片，40 g/多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，行Masson染色法使心肌細胞染成紅色，膠原染成綠色。每張切片隨機選取5個視野，用圖像分析軟件測量膠原組織所占百分率(心肌膠原面積/所測視野面積)，取平均值即為CVF。

1.4 心肌I、III型膠原mRNA表達測定

心肌組織勻漿后，用Trizol法抽提總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應獲得cDNA，實時熒光定量 PCR(美國產(chǎn) ABI 7500型熒光定量 PCR儀)測定心肌 I、III型膠原mRNA含量，引物參照文獻［9］，內(nèi)參基因 GAPDH。引物序列分別為，I型膠原(1075bp):上游 5'-CAAGAATGGCGACCGTGGTGA-3'，下 游 5'-GGTGTGACTCGTGCAGCCAT-3';III型膠原(450bp):上游5'-AGATGGACTAAGTGGACATC-3';下游5'-CATGTTTCTCCGGTTTCCAT-3';GAPDH(308bp):上游 5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，下游 5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'。擴增條件:預變性94℃ /5 min;94℃ /45 s，56℃ /45 s，72℃ /1 min，共 32個循環(huán)，終末延伸72℃/10 min。計算相對表達量=2-△Ct，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。Ct值是指每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.5 心肌蛋白表達測定

心肌組織裂解后提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法對蛋白定量。灌制10%的分離膠和5%的濃縮膠，恒壓120 V、80 mA預電泳10 min，上樣，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。1:1000 兔抗大鼠一抗(Pro-MMP-1、2、3、9、14，MMP-1、2、3、9、14，TGF- β 和 TIMP-1)4℃孵育過夜，TBST洗滌PVDF膜，1:1000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，暗室中滴加發(fā)光底物混合物2 mL于PVDF膜上，曝光、顯影、定影。對目的蛋白進行光密度分析，以GAPDH為內(nèi)參。目的蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，使用SPSS統(tǒng)計軟件(SPSS 14.0 for Windows)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。顯著性水平取α=0.05和α=0.01。

2 結果

2.1 血流動力學參數(shù)

表1結果顯示，與YC組比較，OC組LVSP、±dp/dtmax顯著性下降(均為P＜0.01)，LVEDP則顯著性升高(P＜0.01);與 OC組比較，OE組 LVSP、±dp/dtmax顯著性升高(均為P＜0.01)，LVEDP則顯著性下降(P＜0.01)。

表1 各組大鼠血流動力學參數(shù)比較

2.2 心肌Masson染色與CVF

Masson染色顯示，膠原纖維呈藍色，心肌纖維呈紅色。YC組心肌細胞著色均勻，無明顯膠原成分;OC組心肌細胞減少，纖維化程度明顯，CVF顯著高于YC組(P＜0.01);OE組較OC組心肌細胞增多，膠原纖維(即CVF)顯著減少(P＜0.01)。見圖1。

圖1 各組心肌Masson染色與CVF比較注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 心肌I、III型膠原mRNA表達

圖2 各組心肌I、III型膠原mRNA表達的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 OC組比較，#P ＜0.05，##P＜0.01。

圖2結果顯示，與YC組比較，OC組I、III型膠原mRNA均升高(均為P＜0.01);與OC組比較，OE組I、III型膠原 mRNA則降低(分別為 P＜0.01和P ＜0.05)。

2.4 心肌Pro-MMPs、MMPs蛋白表達

與 YC 組比較，OC 組Pro-MMP-2、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14降低(均為 P ＜0.01)，Pro-MMP-3、TGF-β 和TIMP-1升高(均為P ＜0.01);與OC組比較，OE組Pro-MMP-2和Pro-MMP-3升高(均為 P ＜ 0.01)，Pro-MMP-14、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-14、TGF-β 和 TIMP-1降低(均為 P＜0.01);Pro-MMP-9和MMP-9在各組均無顯著性差異(均為P＞0.01)。見圖3～圖8。

圖3 各組心肌Pro-MMP-1和MMP-1蛋白表達的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖4 各組心肌Pro-MMP-2和MMP-2蛋白表達的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖5 各組心肌Pro-MMP-3和MMP-3蛋白表達的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖6 各組心肌Pro-MMP-9和MMP-9蛋白表達的變化

圖7 各組心肌Pro-MMP-14和MMP-14蛋白表達的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖8 各組心肌TGF-β和TIMP-1蛋白表達的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，10周跑臺運動使衰老大鼠心臟I型和III型膠原表達下調(diào)、CVF下降，MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14表達上調(diào)以及TIMP-1表達下調(diào)，心功能得到逆轉(zhuǎn)。此外，本研究還觀察到，正性調(diào)控TIMP-1的上游信號分子——TGF-β在衰老時顯著上調(diào)，而運動則使其表達下降。上述結果驗證了我們的假設，即規(guī)律運動訓練可延緩心臟衰老過程中的膠原沉積和心肌纖維化并改善心功能，其機制與TGF-β/TIMP-1信號通路受到抑制，MMPs表達上調(diào)有關。

3.1 運動對衰老心臟的保護作用

本研究成功建立衰老大鼠心肌纖維化模型，即與YC組比較，OC組I型和III型膠原mRNA顯著升高，心肌Masson顯示CVF升高，血流動力學測定發(fā)現(xiàn)LVSP、±dp/dtmax顯著性下降，LVEDP則顯著性升高，說明機體衰老的過程中，心臟膠原合成增加，心肌逐漸出現(xiàn)纖維化［10］，心室順應性下降伴心臟舒縮功能障礙，最終導致心力衰竭的發(fā)生。

阻遏及逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為防治惡性心血管病事件發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。學者們嘗試多種方法改善心肌纖維化，例如藥物療法(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑、中藥復方CFX等)［11］、干細胞技術［12］均可抑制心室重塑，但藥物存在各種副作用，而干細胞技術尚處于實驗階段。近年來，運動康復療法在防治心血管疾病中的作用逐漸引起關注，規(guī)律活動可有效改善各年齡人群的心功能，而對于心臟病患者，有氧運動則可減輕其臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，降低死亡率和住院率［7］。相比其他手段，運動療法具有經(jīng)濟、實用、副作用小、易于實施等特點。有研究顯示，運動對心功能的改善作用可能與抑制心臟膠原積累有關［8，13］。Woodiwiss等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，青年大鼠 16 周經(jīng)過隨意滾輪運動，心臟僵硬度降低，而膠原含量則無顯著性變化，提示運動對健康心臟膠原含量影響不大。Choi等［8］報道，長期運動降低了衰老大鼠心臟膠原交聯(lián)(collagen cross-linking)并改善心臟舒張功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，與OC組比較，OE組I型和III型膠原mRNA表達下調(diào)，CVF下降，雖然血流動力學參數(shù)尚未恢復至 YC組水平，但與 OC組比較，LVEDP降低，LVSP、±dp/dtmax升高。上述結果提示，10周跑臺運動通過抑制衰老大鼠心肌膠原合成，延緩甚至逆轉(zhuǎn)了由于衰老造成心肌纖維化和心功能下降，同時也證實了臨床運動康復療法的積極效果。一項隨訪研究證實［15］，優(yōu)秀運動員在70歲時仍能保持較高的心血管功能，因此，規(guī)律運動能夠延緩增齡過程中發(fā)生的心臟機械性和結構性重塑，對于心功能具有保護效應。

3.2 TGF-β/TIMP-1/MMPs信號通路參與了運動對衰老大鼠心肌的保護作用

心肌MMPs介導心臟膠原蛋白降解，但MMPs調(diào)節(jié)異常則可造成心肌纖維化、心臟衰老甚至心力衰竭［16］。TIMP-1作為MMPs的內(nèi)源性抑制劑，能夠與活化的MMPs 1:1結合形成酶-抑制劑復合物，從而抑制MMPs的蛋白水解活性［16］。研究指出，缺血-再灌注損傷［17］和心梗［18］可同時上調(diào)心肌MMPs和TIMP-1表達，而本研究中與YC組比較，OC組雖然Pro-MMPs變化各異(Pro-MMP-3升高，Pro-MMP-2下降，Pro-MMP-1、9、14則無顯著性變化)，但具有活性的MMPs表達均下降而TIMP-1則升高。這一矛盾結果說明自然衰老與疾病造成的心臟異常存在不同的調(diào)節(jié)機制，增齡過程中MMPs活性逐漸降低，膠原降解減少，ECM的更替(turnover)速率加快，膠原逐漸沉積甚至出現(xiàn)纖維化;而心臟疾患則造成MMPs升高，可能與心臟瘢痕組織形成有關［18］。

本研究利用10周跑臺運動干預發(fā)現(xiàn)，與OC組比較，OE 組 MMP-1、MMP-2、MMP-3和 MMP-14表達均顯著升高，提示運動逆轉(zhuǎn)了增齡造成的MMPs下調(diào)表達，促進膠原降解，這可能是運動對抗衰老造成的心肌膠原沉積和心肌纖維化并對衰老心臟起保護作用(心功能改善)的機制之一。運動對MMPs的作用與TIMP-1有關，衰老時TIMP-1升高從而抑制了MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14的表達量，而運動則通過下調(diào)TIMP-1部分解除了對MMPs的抑制作用，提示TIMP-1/MMPs可能是運動防治心臟衰老的干預靶點。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β與心血管疾病密切相關，心肌特異性表達TGF-β可導致心肌肥厚和心肌纖維化。血管緊張素II、內(nèi)皮素等引起心肌纖維化的信號分子均可導致TGF-β增加，因此TGF-β上調(diào)成為諸多因素所致心肌纖維化的共同通路［19］。Brooks等［20］發(fā)現(xiàn)，24月齡TGF-β雜合子小鼠心肌纖維化程度較野生型明顯減輕，生存率和心功能得到改善。藥理研究表明［21］，降低TGF-β表達則可減弱心肌膠原合成，對于心肌纖維化具有潛在應用價值。已證實，TIMP-1是TGF-β下游的效應分子，增齡可升高TGF-β表達量［19］(與本研究結果一致，即TGF-β在OC組顯著高于YC組)，TGF-β通過上調(diào)TIMP-1表達參與了心臟衰老過程。運動對衰老過程中心臟TGF-β/TIMP-1信號通路的影響尚無報道，本研究發(fā)現(xiàn)，與OC組比較，OE組TGF-β表達量顯著下調(diào)，結合上述結果，我們推測，規(guī)律運動通過抑制TGF-β/TIMP-1上調(diào)MMPs表達，因此，TGF-β/TIMP-1/MMPs信號通路參與了運動對衰老大鼠心肌的保護作用。

4 結論

衰老過程中，心臟膠原合成增加、降解減少，膠原含量增多，進而造成心肌纖維化和心功能下降;規(guī)律運動訓練抑制膠原合成并促進膠原降解，延緩心臟衰老過程中的膠原沉積和心肌纖維化并改善心功能，其機制與TGF-β/TIMP-1信號通路受到抑制，MMPs表達上調(diào)有關。

［1］Zhang P，Su J，Mende U.Cross talk between cardiac myocytes and fibroblasts:from multiscale investigative approaches to mechanisms and functional consequences［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，303(12):1385-1396.

［2］Horn MA，Graham HK，Richards MA，et al.Age-related divergent remodeling of the cardiac extracellular matrix in heart failure:collagen accumulation in the young and loss in the aged［J］.J Mol Cell Cardiol，2012，53(1):82-90.

［3］陳敏，吳卉卉，沈曉麗，等.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子與擴張型心肌病的關系［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2011，20(1):27-32.

［4］王永，趙紅佳，曾凱，等.健心顆粒對慢性心衰患者血清MMP-9及TIMP-1的影響［J］.福建中醫(yī)藥大學學報，2012，22(4):5-7.

［5］趙志杰，劉新民，周國鵬，等.老齡大鼠肺內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶2、9及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1、2、3表達變化［J］. 北京大學學報(醫(yī)學版)，2008，40(1):101-104.

［6］Kapur NK.Transforming growth factor-beta:governing the transition from inflammation to fibrosis in heart failure with preserved left ventricular function［J］.Circ Heart Fail，2011，4(1):5-7.

［7］Kitzman DW，Herrington DM，Brubaker PH，et al.Carotid arterial stiffness and its relationship to exercise intolerance in older patients with heart failure and preserved ejection fraction［J］.Hypertension，2013，61(1):112-119.

［8］Choi SY，Chang HJ，Choi SI，et al.Long-term exercise training attenuates age-related diastolic dysfunction:association of myocardial collagen cross-linking［J］.J Korean Med Sci，2009，24(1):32-39.

［9］侯伊玲，薄海，劉子泉，等.運動訓練對心肌梗死后心室重構及MMP-2，MMP-9表達的影響［J］.中國康復醫(yī)學雜志，2010，25(3):200-204.

［10］Sangaralingham SJ，Huntley BK，Martin FL，et al.The aging heart，myocardial fibrosis，and its relationship to circulating C-type natriuretic Peptide［J］.Hypertension，2011，57(2):201-207.

［11］米粟，胡卓偉.抑制心肌纖維化促進心肌再生治療慢性心血管疾病［J］.生理科學進展，2010，41(5):352-358.

［12］鄧瑋，陳慶偉，李興升，等.骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)核轉(zhuǎn)錄因子κB途徑干預心肌纖維化［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(19):3494-3498.

［13］Yengo CM，Zimmerman SD，McCormick RJ，et al.Exercise training post-MI favorably modifies heart extracellular matrix in the rat［J］.Med Sci Sports Exerc，2012，44(6):1005-1012.

［14］Woodiwiss AJ，Oosthuyse T，Norton GR.Reduced cardiac stiffness following exercise is associated with preserved myocardial collagen characteristics in the rat［J］.Eur J Appl Physiol Occup Physiol，1998，78(2):148-154.

［15］Tanaka H，Seals DR.Endurance exercise performance in Mastersathletes:age- associated changes and underlying physiological mechanisms［J］.J Physiol，2008，586(1):55-63.

［16］Essa EM，Zile MR，Stroud RE，et al.Changes in plasma profiles of matrix metalloproteinases(MMPs)and tissue inhibitors of MMPs in stress-induced cardiomyopathy［J］.J Card Fail，2012，18(6):487-492.

［17］Oyamada S，Bianchi C，Takai S，et al.Chymase inhibition reduces infarction and matrix metalloproteinase-9 activation and attenuates inflammation and fibrosis after acute myocardial ischemia/reperfusion［J］.J Pharmacol Exp Ther，2011，339(1):143-151.

［18］Mukherjee R，Snipes JM，Saunders SM，et al.Discordant activation of gene promoters for matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of the metalloproteinases following myocardial infarction［J］.J Surg Res，2012，172(1):59-67.

［19］Hao X，Zhang Y，Zhang X，et al.TGF-beta1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2011，4(3):397-406.

［20］Brooks WW，Conrad CH.Myocardial fibrosis in transforming growth factor beta(1)heterozygous mice［J］.J Mol Cell Cardiol，2000，32(2):187-195.

［21］Chen R，Xue J，Xie ML.Reduction of isoprenaline-induced myocardial TGF-beta1 expression and fibrosis in osthole-treated mice［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，256(2):168-173.