重組腺病毒載體AdOX40Ig 的構建、表達及相關體外實驗

陳志紅，趙媛媛，張守亮，林建揚，魏法星，朱偉

(1.江蘇大學附屬人民醫院普外科，江蘇 鎮江212002;2.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇 鎮江212013)

目前唯一有效治療終末期器官功能衰竭的方法就是器官移植，但是由于存在器官移植排斥反應，傳統的終身免疫治療常常引起各種器官功能衰竭而導致移植失敗［1-2]。因而發展一種新途徑誘導特異性免疫耐受，對于防止發生急性和慢性排斥反應以及避免器官移植后終身免疫抑制治療都是非常重要的。在器官移植中，T 細胞是介導移植排斥反應的主要效應細胞之一，而OX40/OX40L 可以提供T 細胞活化后進一步增殖、分化并最終形成效應T 細胞或者記憶細胞的關鍵共刺激信號［3-5]。因此阻斷OX40/OX40L 間的相互作用，有可能誘導受體針對移植物抗原的特異性T 細胞失能從而產生免疫耐受。已有研究表明，阻斷OX40/OX40L 信號通路可以有限地延長移植皮膚的存活［6]，對移植物抗宿主病有潛在治療意義［7]。

本實驗擬構建含人OX40-IgG1 融合基因的重組腺病毒載體，通過轉染293A 細胞，包裝出具有感染性的完整病毒顆粒，進一步感染肝HL-7702 細胞，并檢測了其感染效率及相關目的基因和蛋白的表達。這將為進一步進行基因誘導免疫耐受從而抑制肝移植排斥反應的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和細胞株 pAdTrack-CMV 穿梭質粒由復旦大學鐘江老師惠贈;pAdeasy-1 由本室凍存;大腸埃希菌DHα、BJ5183 菌株由本室凍存;293A 細胞株來自加拿大Microbix Biosystems 公司;肝細胞HL-7702 來自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫;小鼠抗人OX40 mAb (1F7)由蘇州大學張學光教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶BglⅡ、EcoRⅤ、SalⅠ、PacⅠ、PmeⅠ(New England Biolab 公司);T4DNA 連接酶和TaqDNA 聚合酶(TaKaRa 生物技術公司);PCR 產物回收試劑盒(Qiagen 公司);質粒抽提試劑盒(杭州V-gene 公司);Lipofect Amine 2000 試劑盒(Gibco Brl 公司);小牛血清(Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 轉移質粒pTOX40Ig 的構建 根據基因庫公布的人OX40 和hIgG1 Fc 片斷序列設計引物，經PCR 擴增后，hOX40 PCR 擴增產物用BglⅡ和SalⅠ進行雙酶切，hIgG1 Fc 用SalⅠ和EcoRⅤ進行雙酶切，最后pAdTrack-CMV 用BglⅡ和EcoRⅤ雙酶切。然后經核酸瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒回收體系中hOX40 片段、hIgG1 Fc 片段和pAdTrack-CMV 的DNA 片段，接著將它們在基因重組連接反應體系中16 ～18 ℃連接過夜。連接產物轉化大腸埃希菌，用LB 培養板(卡拉霉素30 μg/mL)篩選陽性克隆，提取質粒，然后經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定過的陽性質粒送北京奧科公司進行DNA測序，將測序正確的質粒命名為pAdTrack-CMVOX40Ig(pTOX40Ig)。

1.2.2 重組腺病毒質粒pAdOX40Ig 和pAdGFP 的構建 把質粒pAdTrack-CMV、pTOX40Ig 分別經PmeⅠ單酶切線性化后，進行電泳和產物膠回收。膠回收片段與pAdeasy-1 腺病毒質粒以氯化鈣法分別共轉化BJ5183 感受態細胞。挑選陽性克隆進行PCR 及PacⅠ酶切鑒定。將鑒定正確的重組腺病毒質粒pAdOX40Ig、pAdGFP，分別轉化DHα 感受態細胞，將轉化子大量擴增保種。

1.2.3 重組腺病毒AdOX40Ig 的制備 用堿裂解法抽提重組腺病毒質粒pAdOX40Ig 和pAdGFP，經PacⅠ酶切線性化后，按Lipofectamine 2000 操作說明轉染70%貼壁的293A 細胞。轉染后更換為含5%FBS 的DMEM 培養基，隔2 ～3d 換1 次培養液，繼續培養10 ～14d，第3 ～5 天在熒光顯微鏡下觀察熒光。待細胞有噬斑病變時收集細胞懸液，2000 r/min 離心5 min，細胞沉淀用無菌PBS 洗滌2 ～3 次后，將細胞懸液在-80 ～37 ℃間反復凍融3 次，釋放出病毒，2000 r/min 離心5 min，取上清，經多輪感染后獲得高滴度重組腺病毒AdOX40Ig 和空載體病毒AdGFP，于-80℃凍存。

1.2.4 AdOX40Ig 和AdGFP 轉染293A 細胞及RTPCR 鑒定OX40Ig 用AdOX40Ig 和AdGFP 分別轉染293A 貼壁細胞3 h，更換含10%小牛血清的RPMI1640 培養液后在37 ℃條件下繼續培養。3d 后提取RNA，采用RT-PCR 鑒定OX40Ig。

1.2.5 AdOX40Ig 重組腺病毒感染效率的檢測AdOX40Ig 重組腺病毒體外感染HL-7702 細胞，分為3組，分別為HL-7702 細胞對照未感染組、HL-7702 +Ad 空病毒感染組、HL-7702 +Ad-OX40Ig 重組腺病毒感染組，采用1、10、100、200 MOI 劑量感染，實驗各設3 個平行孔。48 h 后分別在普通光鏡視野下觀察HL-7702 細胞生長形態和熒光視野下觀察GFP 綠色熒光表達情況，以判斷重組腺病毒不同感染劑量對HL-7702 細胞生長的影響及其感染效率，旨在篩選最佳感染劑量進行重組腺病毒感染和生物學功能研究。

1.2.6 間接免疫熒光檢測外源性OX40Ig基因的表達 利用免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3 進行間接免疫熒光，檢測腺病毒介導的外源性OX40Ig基因在HL-7702 細胞中的表達，方法按免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3 說明書進行。

1.2.7 AdOX40Ig 轉染的細胞上清中OX40Ig 蛋白的測定 采用夾心酶聯免疫吸附試驗測定肝HL-7702 細胞上清中OX40Ig 含量。在37 ℃下用MOI為10 的AdOX40Ig 對HL-7702 細胞感染3 h，收集培養上清，用羊抗人IgG Fc 段單克隆抗體2 μg/mL包被96 孔ELISA 反應板，最后經ELISA 檢測儀檢測450 nm 處D值。同時設定完全空白對照及空載腺病毒AdGFP 對照。

2 結果

2.1 轉移質粒pTOX40Ig 的鑒定

重組后的轉移質粒pTOX40Ig 經雙酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果發現與OX40Ig融合基因大小一致，提示轉移質粒pTOX40Ig 構建成功(圖1)。

圖1 轉移質粒pTrack-CMV-hOX40Ig(pTOX40Ig)的鑒定Fig 1 Identification of recombinant vector pTrack-CMV-hOX40Ig (pTOX40Ig)by restriction enzymedigestion

2.2 重組腺病毒質粒pAdOX40Ig 的鑒定

PacⅠ酶切鑒定重組后的腺病毒質粒pAdOX40Ig，能釋放出大小約1300 bp 的片段，提示重組腺病毒質粒pAdOX40Ig 已成功構建(圖2)。

圖2 重組腺病毒質粒的鑒定Fig 2 Identification of recombinant adenovirus plasmid pAdOX40Ig

2.3 重組腺病毒AdOX40Ig 的制備及鑒定

鑒定正確的重組腺病毒質粒pAdOX40Ig 經PacⅠ酶切后，按Lipofectamine 2000 操作說明轉染293A 細胞。轉染第3 天在熒光顯微鏡下能觀察到熒光，提示轉染成功(圖3)。用pAdOX40Ig 和pAdGFP 分別轉染293A 細胞，培養后采用RT-PCR鑒定OX40Ig。只有AdOX40Ig 組出現1 條大小約1300 bp的條帶，提示重組腺病毒質粒AdOX40Ig 已成功制備(圖4)。

圖3 轉染293A 細胞后第3 天重組腺病毒質粒pAdOX40IgFig 3 Threedays after recombinant adenovirus plasmid pAdOX40Ig were transfected into 293A cells，green fluorescent protein were observed in cells

圖4 重組腺病毒AdOX40Ig 和AdGFP 的PCR 鑒定Fig 4 Identification of AdOX40Ig and AdGFP

2.4 重組腺病毒AdOX40Ig 的感染效率

實驗結果發現，普通光鏡下只有200 MOI 劑量感染組細胞圓縮、脫落，呈現明顯的細胞毒性，10、100 MOI 劑量病毒感染HL-7702 細胞后對細胞幾乎無毒性，而且有很高的感染效率，可達90%以上，而1 MOI 劑量病毒感染HL-7702 細胞后雖然無細胞毒性但感染效率很低，提示10 MOI 為最佳感染劑量(圖5)。

圖5 重組腺病毒AdOX40Ig 的體外感染效率(×200)Fig 5 Infected efficiency of recombinant adenovirus AdOX40Ig in HL-7702 cells

2.5 人肝細胞中外源性OX40Ig 基因的表達

用AdOX40Ig 重組腺病毒和Ad 空載體腺病毒分別感染HL-7702 細胞，然后利用免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3 進行間接免疫熒光檢測，結果發現AdOX40Ig 感染組HL-7702 細胞能檢測到Cy3 紅色熒光，而Ad 空載體腺病毒感染組和未感染組則未出現紅色熒光。這表明腺病毒介導的外源性OX40Ig基因能在HL-7702 細胞中成功表達(圖6)。

圖6 OX40Ig 基因在HL-7702 細胞中的表達Fig 6 OX40Ig gene expression in HL-7702 cells wasdetected by indirect Immuno fluorescence assay

2.6 AdOX40Ig 轉染的細胞上清中OX40Ig 蛋白的含量

ELISA 法測定結果經統計學軟件SPSS 16.0 分析，空白對照組OX40Ig 蛋白含量為(2.33±2.52)μg/mL，AdGFP 組為(4.33 ±2.52)μg/mL，AdOX40Ig 處理組為(34. 00 ± 4.58)μg/mL，經方差分析，F=88.326，P=0.0001，組間差異具有統計學意義，可認為AdOX40Ig 處理組的OX40Ig 蛋白表達水平高于空白對照組和AdGFP 組。

3 討論

T 細胞是介導免疫排斥反應的主要效應細胞，阻斷T 細胞活化所需的共刺激信號，有可能誘導受體針對移植物抗原的特異性T 細胞失能，從而產生免疫耐受并抑制排斥反應的發生［8]。目前研究最為廣泛的兩條共刺激途徑是CD28/B7 和CD40/CD154 途徑，已證實同時阻斷兩條途徑或其中之一可延長移植物存活［9-11]。另外還有一些新的介導移植物排斥的共刺激途徑如OX40/0X40L 途徑［12]。OX40 是一種跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，最早發現其表達于大鼠活化的T 細胞表面，后來證實也存在于小鼠和人活化的T 細胞表面。OX40 的配體(OX40L)，屬于2 型糖蛋白TNF家族，研究發現小鼠的B 細胞和人的內皮細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞的表面均有OX40L 的表達［13]。兩者結合形成的OX40/OX40L 是T 細胞活化后進一步增殖、分化，并最終形成效應T 細胞或者記憶細胞的關鍵共刺激信號。因此阻斷OX40/OX40L 途徑能夠抑制T 細胞的活化和移植物排斥反應［14]。

有研究顯示，各種IgG 中，IgG1 的Fc 段與OX40的胞外區融合所構建的融合蛋白與OX40L 親和力最強 。本研究中，我們首先將hOX40 片段、hIgG1 Fc 片段和pAdTrack-CMV 的DNA 片段連接、轉化并鑒定構建了轉移質粒 pAdTrack-CMV-OX40Ig(pTOX40Ig)，再與pAdeasy-1 在大腸埃希菌BJ5183中進行同源重組，構建成重組腺病毒質粒pAdOX40Ig，隨后經包裝、擴增、純化及鑒定后感染肝HL-7702 細胞。經間接免疫熒光檢測，結果顯示腺病毒介導的外源性OX40Ig基因能在HL-7702 細胞中成功表達，又采用夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定AdOX40Ig 感染的HL-7702 肝細胞上清中OX40Ig 的含量，結果發現AdOX40Ig 處理組高于空白對照組和AdEGFP 對照組，且差異有統計學意義。以上結果表明，我們已成功構建了重組腺病毒載體AdOX40Ig，并且OX40Ig基因及蛋白均可在HL-7702 肝細胞中成功表達。這就為肝移植時將目的基因OX40Ig導入肝細胞奠定了基礎，同時使得通過阻斷OX40/0X40L 途徑抑制肝移植排斥反應成為可能。

近年來在誘導肝移植免疫耐受機制方面已取得了很大進展，但實際應用于臨床的還很少。我們的研究旨在通過將OX40Ig基因轉入移植物的途徑誘導特異性免疫耐受，在此基礎上進行相關體內實驗及臨床應用等更深入的研究，可能會在器官移植領域有很好的應用價值。

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