慢性乙型肝炎HBeAg 血清學轉換與HBV 特異性細胞毒T 淋巴細胞、基因型的關系

吳寅濤，周玉麟 ，王學才

(1.宜興市人民醫院感染科，江蘇 宜興214200;2.宜興市人民醫院川埠分院感染科，江蘇 宜興214200)

在慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒治療中，乙型肝炎病毒e 抗原(HBeAg)血清學轉換是評價抗病毒療效的重要標志之一。國內外研究顯示，影響HBeAg 血清學轉換的因素有多方面，但關于阿德福韋酯治療CHB 患者后，HBeAg 血清學轉換與乙型肝炎病毒(HBV)基因型、特異性細胞毒T 淋巴細胞(CTL)關系的相關研究并不多，本文通過觀察采用阿德福韋酯治療的80例CHB 患者，探討其HBeAg血清學轉換與外周血HBV 特異性CTL、HBV 基因型的關系。

1 對象與方法

1.1 臨床資料

收集2009年1月至2012年5月我院感染科CHB 患者80例，診斷符合2005年慢性乙型肝炎防治指南的標準。其中男44例，女36例，年齡22 ～59(33.91 ±9.02)歲，病程1 ～10年;HBeAg 陽性50例(62.5%);所有患者均符合HBV DNA 陽性(HBV DNA≥1 ×105拷貝/mL);肝功能異常，丙氨酸轉氨酶(ALT)＞2 ×正常值上限;人白細胞抗原(HLA)-A2陽性;均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染;無自身免疫性疾病;無長期大量飲酒史;無使用肝毒性藥物史;以前未使用核苷(酸)類似物和干擾素抗病毒治療或使用免疫調節藥物。

1.2 治療方法

患者服用阿德福韋酯(江蘇省連云港正大天晴藥業公司)10 mg，1 次/d，口服，療程12 個月。

1.3 檢測方法

HBVM 和HBV DNA:HBVM(HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc)應用AusBio 全自動酶免分析儀和上海科華公司試劑檢測;HBV DNA:采用PCR 法，上海達安試劑檢測。肝功能:用Olympus AU2700 全自動生化分析儀檢測。

HLA-A2等位型的鑒定:取100 μL 肝素抗凝新鮮全血，加入檢測管和對照管，分別加入HLAA2-PE 及同型對照10 μL，室溫避光孵育30 min，經溶血處理后用流式細胞儀(BD FACSCalibur)和美國BD 公司試劑檢測。HBV 特異性CTL:試管中加入10 μL 藻紅蛋白標記的HLA-肽四聚體和CD8-異硫氰酸熒光素、CD3-PC5，再加入100 μL 的肝素抗凝血，同時做同型對照，混勻室溫避光孵育20 min，溶血洗滌后，流式細胞儀檢測，以CD3+淋巴細胞設門計數50000 個CD8+細胞和HLA-肽四聚體雙陽性細胞為特異性CD8+細胞，并以占總計數CD8+細胞的百分比表示，美國BD 公司試劑檢測。HBV 基因型:采用PCR 微板核酸雜交-ELISA技術，PE9600 型基因擴增儀(美國PE 公司)，試劑為第一軍醫大學基礎生物醫學診斷研究中心提供。引物及探針:選擇前C 區的不同序列作為PCR引物和核酸雜交探針，6 個基因型通用的序列作為PCR 的引物和通用包被探針，而同一部位的不同序列作為各型的顯色探針。顯色探針5＇標記生物素，由上海生物工程公司合成。引物序列:引物1，5＇-CCCTTCTTCGTCTGCG-GTTCC-3＇(ntl490-1510)，引物2，5＇-ACCAATTTATGCCTACAGCCTC-3＇(ntl 798-1777)，按說明書操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件。計數資料用百分數表示，采用χ2檢驗，計量資料用均數± 標準差(ˉ±s)表示，采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBeAg 血清學轉換率

HBeAg 陽性50例中發生HBeAg 轉陰14例(28%);HBeAg 血清學轉換9例(18%)，無HBeAg血清學轉換41例(82%)。

2.2 HBeAg 血清學轉換率與HBV 基因型的關系

HBeAg 血清學轉換9例中，B 基因型7例，占B基因型30.77%，C 基因型1例，占C 基因型4.17%;兩種基因型比較，差異有統計學意義(χ2=4.32，P＜0.05)。

2.3 CHB 患者治療前與治療后12 個月肝功能、HBV DNA 和HBV 特異性CTL 水平比較

80例CHB 患者治療前與治療后12 個月肝功能、HBV DNA 和HBV 特異性CTL 水平比較，見表1。

表1 治療前與治療后12 個月患者肝功能、HBV DNA 和HBV 特異性CTL 水平比較±s

表1 治療前與治療后12 個月患者肝功能、HBV DNA 和HBV 特異性CTL 水平比較±s

組別 n 丙氨酸轉氨酶/U·L -1總膽紅素/μmol·L -1白蛋白/g·L -1 HBV DNA/log10拷貝·(mL)-1 HBV 特異性CTL/%治療前 80 253.49 ±119.91 19.61 ±10.21 41.44 ±3.21 6.25 ±0.70 0.34 ±0.10治療后 80 40.11 ±6.15 17.19 ±5.86 42.31 ±3.51 3.01 ±0.25 0.68 ±0.11 t 值 11.51 1.79 0.18 12.62 8.58 P 值＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

目前研究認為，乙型肝炎的發病機制主要是機體清除HBV 而引發的細胞免疫病理改變;機體清除HBV 的細胞免疫機制可分為特異性與非特異性2種，其中特異性細胞免疫應答可能是機體清除病毒的重要途徑。HBV 特異性CTL 應答在乙型肝炎發病機制中的作用日益受到重視，在未經治療的慢性乙型肝炎患者體內，往往存在T 細胞的低反應［1]。本研究顯示，除能明顯降低CHB 患者ALT 及HBV DNA 外，阿德福韋酯還能提高CHB 患者的HBV 特異性CTL 功能，治療12 個月后HBeAg 血清學轉換者與HBV 特異性CTL 水平升高可能有關，并可能與HBV 基因型有關。

國外研究認為阿德福韋酯的抗病毒作用與HBV 基因型無關［2]，這主要是由于國外研究多關注基因A 型與D 型，觀察基因B 型與C 型較少，而我國患者感染以基因B 型與C 型為主［3]。曾愛中等［4]研究認為，阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎48 周時，部分病毒學指標(如血清HBV DNA 下降均值和HBV DNA 陰轉率)B 基因型HBV 感染者優于C 基因型。本研究發現，HBeAg 血清學轉換者9例中，B基因型7例(占B 基因型30.77%)，C 基因型2例(占C 基因型4.17%)，B 基因型HBeAg 血清學轉換明顯高于C 基因型。據此推斷，HBV 基因型(B型與C 型)可能是阿德福韋酯治療HBV 患者發生HBeAg 血清學轉換的影響因素之一。

［1]Rehermann B，Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection［J]. Nat Rev Immunol，2005，5(3):215-229.

［2]Westland C，Delaney WT，Yang H，et al. Hepatitis B virus genotypes and virologic response in 694 patients in phase Ⅲstudies of adefovirdipivoxil［J]. Gastroenterology，2003，125(1):107-116.

［3]Zeng G，Wang Z，Wen S，et al. Geographicdistribution，virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in china［J]. J Viral Hepat，2005，12(6):609-617.

［4]曾愛中，鄧惠，彭鳳英，等. B 和C 基因型乙型肝炎病毒對阿德福韋酯治療的病毒學應答比較［J].中華肝臟病雜志，2008，16(6):412-415.