人皮膚成纖維細胞的分離培養及鑒定＊

吳艷紅 鄧安彥 李曉紅 曾文光 左鳳瓊

（1.四川省人民醫院輸血科，四川 成都 610072；2.南充市中心醫院輸血科，四川 南充 637000；3.四川大學華西藥學院生化教研室，四川 成都 610041；4.遂寧市中醫院檢驗科，四川 遂寧 629000；5.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川 成都 610041）

成纖維細胞（Fibroblasts，Fbs）是皮膚真皮網織層中最重要的細胞，主要存在于疏松結締組織中，能合成和分泌大量膠原蛋白，對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用［1］。在皮膚的燒傷、撕脫傷等創傷均會造成不同程度的細胞變性、壞死，需要通過細胞增生和細胞間基質的形成來進行組織修復。在衰老或損傷的皮膚修復過程中加入自體和／或異體的成纖維細胞，可以使構建的真皮具有更有細胞活性，更能迅速促進表皮細胞的遷移和增殖，從而快速修復衰老、損傷部位，使皮膚變年輕或創傷迅速愈合。真皮的構建所需要的種子細胞－成纖維細胞在體外分離培養后，隨著傳代次數的增加增殖能力逐漸下降，因此建立一種穩定的、高效的成纖維細胞的分離培養方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 臨床無菌切除幼兒包皮。

1.1.2 試劑及抗體

高糖－DMEM培養基購自成都哈里公司；小牛血清購自Gibco公司；25cm2塑料培養瓶購自Thermfisher公司；胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶均購自Sigma公司。兔抗波形蛋白（Vmientin）抗體購自博士德公司；余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 原代培養

取臨床無菌切除幼兒包皮，于超凈工作臺上用含青霉素100U·ml－1、鏈霉素100U·ml－1的PBS充分洗滌，D－hanks清洗一次，剔除皮下組織后用無菌眼科剪將皮膚標本剪成小塊，放置于Ⅱ型膠原酶消化液中4℃消化過夜，24h后于超凈臺中無菌分離表皮和真皮。棄表皮，將真皮剪碎，然后轉移至0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）中約15min，以含10%小牛血清的高糖－DMEM培養液終止消化，2000r·min－1離心5min，將沉淀物接種于25cm2塑料培養瓶，加約4ml含10%小牛血清的高糖－DMEM培養液，注意勿使組織浮起，將培養瓶置于37℃、5%CO2培養箱中，次日補加培養液5ml。原代細胞長滿約80%以上即可傳代，傳代時用0.25%胰酶（不含EDTA）消化，倒置顯微鏡下見胞體回縮時輕拍培養瓶，并接著加入含10%小牛血清的DMEM－高糖培養液中止消化，吸管輕輕吹打瓶壁細胞，并將細胞收集于10ml離心管。2000r·min－1離心5min，棄上清，按1：3接種傳代，常規培養。

1.2.2 成纖維細胞的組化鑒定

取P4代細胞以3－5×104個·ml－1接種于預先放有無菌蓋玻片的6孔板內制作細胞爬片，37℃、5%CO2培養4h后取出爬片，PBS洗3次。4%的多聚甲醛（pH 7.2）固定細胞30min，PBS洗3次。接下來按試劑盒操作說明進行細胞鑒定采用免疫化學染色S－ABC法，一抗為波形蛋白（Vimentin）兔抗單克隆抗體，按1∶100比例稀釋，新鮮配置的DAB顯色液，室溫下顯色約為2－3min，復染，封片。光學顯微鏡100倍視野下觀察計數陽性細胞，計算陽性細胞數的百分比。

2 結果

2.1 細胞形態

接種后24h觀察可見有很多長梭形的細胞從組織塊周邊遷出，也有部分多邊形的上皮細胞遷出成團生長，另外可見少量折光強的圓形細胞，見圖1，該細胞隨換液和傳代逐漸去除。一般5－6d后原代細胞鋪滿瓶底80%－90%時進行細胞傳代，傳代比例1∶3。傳代后細胞形態較清楚，基本只見胞體細長呈長梭形，核卵圓形居中的成纖維細胞，見圖1，細胞長至匯合度達90%左右時時細胞呈柵欄狀、漩渦狀、菜花狀生長，5－6d后長至匯合度90%以上，可連續傳代20次以上。

2.2 免疫組化

細胞爬片經過固定后，按試劑盒說明書進行操作。通過摸索一抗和二抗濃度，發現在一抗抗Vmientin濃度為1：100，二抗抗山羊抗兔IgG－辣根過氧化物酶濃度為1：200時細胞爬片的免疫組化效果最好，我們的結果顯示試驗組成纖維細胞幾乎100%Vimentin表達陽性，而陰性對照爬片無陽性產物，見圖2。

圖1 原代培養細胞（4×10） 傳代培養細胞（10×10）

圖2 免疫組化陰性對照 免疫線化陽性結果

3 討論

不同的細胞，由于具有不同的功能，分布著不同的蛋白質。上皮細胞具有特異的角蛋白，肌細胞具有特異的橋連蛋白，而成纖維細胞則包含有特異的波形蛋白。利用其特異標志蛋白，可以成功鑒定成纖維細胞［2］。本研究利用胰蛋白酶和膠原酶聯合消化法培養皮膚成纖維細胞，免疫組化顯示我們所分離培養的細胞波形蛋白陽性，結合分離時的組織來源，以及其生長形態特點，證實其為成纖維細胞，表明我們培養成纖維細胞的方法是穩定可行的。

成纖維細胞是皮膚真皮層疏松結締組織中，能合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白、層黏蛋白等細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）［3］。膠原蛋白是細胞外基質中的主要結構蛋白。當皮膚衰老時，細胞外基質中膠原蛋白含量逐漸降低，導致真皮層結構發生改變，皮膚失去彈性，出現皺紋［4，5］。成纖維細胞的成功培養可為人類凹陷性瘢痕修復和美容除皺提供可靠的細胞來源，并且為解決皮膚的大面積創面修復提供了光明的前景。

1 吳國平，周燕，譚文松，等.人皮膚成纖維細胞在二維和三維培養系統中的生長代謝特性［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（1）：74－77.

2 楊志明主編.組織工程學［M］.北京：化學工業出版社，2002，155－158.

3 吳國選，伍津津，朱堂友，等.人皮膚成纖維細胞庫的構建［J］.實用醫學雜志，2005，22（4）：324－326.

4 王曦.成纖維細胞與皮膚老化［J］.中國美容醫學，2005，14（2）：243－245.

5 Ori T，Okumura M，Matsuura M，et al.Effects of chitinand it s derivatives on the proliferation and cytokine production of fibroblasts in vitro［J］.Biomaterials，1997，8（13）：947－951.