丙戊酸聯(lián)合順鉑對(duì)人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用研究

蔣鳳琴，袁玉梅，汪榮華，姚 沖，曹恒斌

原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，目前對(duì)原發(fā)性肝癌的治療仍以手術(shù)切除為首選方法。對(duì)無法手術(shù)的患者，化療單獨(dú)使用效果不理想，目前多采用肝動(dòng)脈栓塞化療(TACE)。TACE可增加病灶局部濃度，提高療效，還能減輕全身毒性反應(yīng)。常用的藥物有順鉑(DDP)、吉西他濱等。丙戊酸(VPA)作為一線抗癲疒間藥物，已長期應(yīng)用于臨床，其藥理毒理已比較明確。在臨床用藥劑量范圍內(nèi)，能夠有效抑制去乙酰化酶(HDACs)活性，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化、促使細(xì)胞周期阻滯而抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖。多項(xiàng)研究均證實(shí)了VPA對(duì)肝癌細(xì)胞具有抑制作用［1-4］。本研究通過使用不同濃度的VPA聯(lián)合順鉑對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2、BEC7404、SMMC7721的抑制作用，離體評(píng)價(jià)VPA聯(lián)合順鉑對(duì)人肝癌細(xì)胞的療效，探索其對(duì)肝癌在聯(lián)合化療過程中的增效作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Dynex，日本);顯微鏡(Leica，德國);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國);恒溫培養(yǎng)箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠);水浴箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);凈化操作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)。

1.2 材料 VPA(購自Sigma公司);順鉑(購自齊魯制藥有限公司，0100241DB);MTT(購自Amresco公司);DMSO(購自Amresco公司);DMEM(購自GIBCO公司);胎牛血清(購自GIBCO公司);青霉素/鏈霉素雙抗(購自GIBCO公司);胰蛋白酶(購自GIBCO公司);人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫);人肝癌細(xì)胞系BEC7404細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫);人肝癌細(xì)胞系SMMC7721細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取人肝癌細(xì)胞系HepG2、BEC7404、SMMC7721細(xì)胞，應(yīng)用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。每2 d換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)活細(xì)胞≥95%并計(jì)數(shù)細(xì)胞，備用。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長期人肝癌細(xì)胞系 HepG2、BEC7404、SMMC7721細(xì)胞，以5 ×104/孔接種于6孔板。37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為300 μg/mL 的VPA、18 μg/mL 的 DDP，DDP+VPA 組為 18 μg/mL+300 μg/mL。處理24、48、72 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期人肝癌細(xì)胞系HepG2、BEC7404、SMMC7721，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為5×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板，37℃、5%CO2過夜貼壁培養(yǎng)24 h后，分別加入3種不同濃度的VPA溶液10 μL，使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度梯度為 300 μg/mL、100 μg/mL、33 μg/mL，加入3種不同濃度的DDP溶液10 μL，使細(xì)胞培養(yǎng)液濃度梯度為 18 μg/mL、6 μg/mL、2 μg/mL，得VPA聯(lián)合DDP共9組(見表1)，并設(shè)不加藥物的細(xì)胞作為對(duì)照組。

表1 VPA+DDP的9組濃度梯度(μg/mL)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入 MTT 液(5 mg/mL)10 μL，37℃避光培養(yǎng)4 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液后，每孔加入DMSO 100 μL，溶解紫藍(lán)色結(jié)晶，輕輕振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。將96孔板置全自動(dòng)酶標(biāo)儀上，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD)值，測(cè)定每孔490 nm波長OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，每一次、每一濃度及每時(shí)段均設(shè)3復(fù)孔。計(jì)算不同作用時(shí)間各組物質(zhì)對(duì)A549細(xì)胞及HepG2細(xì)胞的抑制率。按下式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率(IR):IR=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算用q表示，q=R(A+B)［RA+(1-RA)/RB］。R(A+B)為兩藥聯(lián)合使用時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率，RA為A藥對(duì)細(xì)胞的抑制率，RB為B藥對(duì)細(xì)胞的抑制率。若q值在0.85～1.15范圍內(nèi)，表示兩藥作用相加;q值＞1.15表明兩藥作用協(xié)同;q值＜0.85表示兩藥合用有拮抗作用。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)的影響 單獨(dú)使用VPA或使用DDP處理人肝癌細(xì)胞系 HepG2、BEC7404、SMMC7721細(xì)胞，在24 h后其細(xì)胞數(shù)目開始減少，但細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化;VPA聯(lián)合DDP處理，其細(xì)胞數(shù)目減少略為明顯，細(xì)胞形態(tài)略有變化。但隨著處理時(shí)間延長，VPA組、DDP組、VPA+DDP組的細(xì)胞數(shù)目均減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。至72 h后，VPA組、DDP組、VPA+DDP組細(xì)胞數(shù)目減少十分明顯，其中，VPA+DDP組較單獨(dú)用藥組減少更為顯著，其細(xì)胞形態(tài)大小不等，多成球形，高倍鏡檢可見核固縮加劇、胞漿減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞脫壁呈半懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)基中有較多的細(xì)胞碎片及死細(xì)胞。見圖1(處理72 h)。結(jié)果表明，在對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2、BEC7404、SMMC7721的增殖抑制上，VPA聯(lián)合DDP組具有更為顯著的抑制效果，且隨著作用時(shí)間的延長，其抑制作用有增強(qiáng)的趨勢(shì)。

3.2 VPA聯(lián)合DDP對(duì)人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用 使用三組不同濃度的VPA、DDP、VPA+DDP處理對(duì)數(shù)生長期的 HepG2、BEC7404、SMMC7721細(xì)胞24、48、72 h后，MTT比色法顯示，對(duì)照組細(xì)胞生長率明顯高于各實(shí)驗(yàn)組，各實(shí)驗(yàn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合用藥組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率(IR)更為顯著，且隨著藥物濃度增加及作用時(shí)間延長，各組對(duì)細(xì)胞增殖IR明顯增加。見表2～表7。表明VPA聯(lián)合DDP對(duì)人肝癌細(xì)胞生長有更強(qiáng)的抑制作用，且這種抑制作用的強(qiáng)度與藥物濃度、作用時(shí)間有關(guān)。

3.3 聯(lián)合用藥對(duì)人細(xì)胞增殖抑制率的影響 通過計(jì)算各組藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率(IR)，進(jìn)一步計(jì)算VPA聯(lián)合DDP對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖IR的增強(qiáng)是否具有協(xié)同作用。使用q值來表示兩藥聯(lián)用的協(xié)同作用。結(jié)果表明，VPA為300 μg/mL及100 μg/mL時(shí)，兩藥物聯(lián)合使用有明確的協(xié)同作用;當(dāng)VPA為33 μg/mL時(shí)，其協(xié)同作用不夠明確。DDP的濃度及作用時(shí)間對(duì)兩藥物的協(xié)同作用無明顯影響。見表8。

圖1 VPA、DDP、VPA+DDP 對(duì) HepG2、BEC7404、SMMC7721 的增殖抑制

表2 VPA、DDP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

表3 VPA+DDP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

表4 VPA、DDP對(duì)BEC7404細(xì)胞增殖的影響

表5 VPA+DDP對(duì)BEC7404細(xì)胞增殖的影響

表6 VPA、DDP對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的影響

表7 VPA+DDP對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的影響

表8 聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率的q值

4 討論

當(dāng)前國際上將去乙酰化酶抑制劑(HDACI)作為治療腫瘤的一個(gè)新的前沿，VPA作為Ⅰ和Ⅱ型HDACI，可以有效促使多種腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和代謝改變，抑制細(xì)胞生長、分化及凋亡用［5-6］。Takai等［7］發(fā)現(xiàn)，VPA能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長，細(xì)胞周期分析顯示，HDACIs可以減少S期細(xì)胞的比例，增加G0-G1與/或G2-M的細(xì)胞比例。侯華英等［8］探討VPA對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖機(jī)制，結(jié)果表明，VPA通過增加Caspase3蛋白表達(dá)，下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。羅恒等［9］發(fā)現(xiàn)，VPA可抑制肺癌A549細(xì)胞生長，改變細(xì)胞周期分布，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

在治療肝癌方面，Armeanu等［1］發(fā)現(xiàn)，VPA 對(duì)肝癌細(xì)胞具有抗增殖與凋亡作用，且對(duì)肝細(xì)胞沒有影響。時(shí)昌文等［2-4］證實(shí)了丙戊酸鈉對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2的生長抑制作用與濃度呈劑量依賴趨勢(shì)，上調(diào)Caspase3、Caspase9的蛋白表達(dá)及活性可能是VPA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑。此外，VPA通過逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞組蛋白低乙酰化修飾水平來抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，下調(diào)MMP-2與MMP-9蛋白表達(dá)可能是其發(fā)揮作用的主要機(jī)制之一。

VPA作為HDACI，可以增強(qiáng)多種化療藥物的療效。Trus等［10］發(fā)現(xiàn)，VPA聯(lián)合全反式維甲酸(ATRA)在治療急性骨髓系白血病(AML)中，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的敏感性。兩組不同臨床試驗(yàn)分別顯示出VPA聯(lián)合ATRA對(duì)部分患者具有緩解作用［11-12］。Catalano等［13］研究發(fā)現(xiàn)，VPA 在治療癲疒間的濃度范圍，可以增強(qiáng)阿霉素對(duì)未分化甲狀腺癌細(xì)胞的作用。VPA可以促使微管蛋白乙酰化，增強(qiáng)紫杉醇(Taxol)在甲狀腺癌細(xì)胞株中的凋亡活性［14］。Hubaux 等［15］證實(shí)，在小細(xì)胞肺癌(SCLC)的臨床前治療上，VPA聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案(DDP聯(lián)合依托泊苷)，可以有效提高化療藥物的療效。李益清等［16］報(bào)道，丙戊酸聯(lián)合阿糖胞苷(Ara-C)對(duì)白血病細(xì)胞株 HL-60及耐藥細(xì)胞株HL-60/HT具有協(xié)同療效，VPA還能抑制HL-60/HT，降低耐藥細(xì)胞株對(duì)Ara-C的耐藥性。

VPA在治療癲疒間時(shí)的血漿濃度一般≤100 μg/mL，高于此濃度可能會(huì)發(fā)生較嚴(yán)重的不良反應(yīng)。本研究將100 μg/mL作為基值，選擇3組濃度梯度，考察了VPA聯(lián)合化療藥物DDP對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組的抑制率較單藥組顯著增強(qiáng)，并且與藥物濃度、作用時(shí)間呈依賴趨勢(shì)，在VPA較高濃度(≥100 μg/mL)時(shí)，聯(lián)合組具有明顯的協(xié)同優(yōu)勢(shì)。

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