‘琯溪蜜柚’貯藏期間汁胞粒化與木質素代謝的關系

潘騰飛 朱學亮等

摘 要： 【目的】為了探討‘琯溪蜜柚貯藏過程中汁胞粒化與木質素的關系，以及外源激素對木質素合成與汁胞粒化的影響，【方法】以‘琯溪蜜柚果實為材料，利用水楊酸（SA）處理低溫貯藏的‘琯溪蜜柚果實，測定了貯藏過程中汁胞粒化指數、木質素含量以及木質素合成途徑中關鍵酶的活性。【結果】結果表明，汁胞粒化指數、木質素含量、木質素合成關鍵酶的活性在整個貯藏過程中逐漸升高，SA處理的木質素合成的關鍵酶PAL、CAD和POD的活性均顯著低于對照，木質素含量和粒化指數也顯著低于對照。木質素含量與粒化指數的相關系數為0.943，木質素合成酶的活性與木質素含量的相關系數為0.981。【結論】研究認為，‘琯溪蜜柚采后貯藏期間汁胞粒化程度與汁胞中木質素含量為正相關的關系，適宜濃度的SA對汁胞粒化的抑制作用主要是通過抑制木質素合成途徑中關鍵酶的活性，減少木質素的合成，從而減輕汁胞粒化的程度。

關鍵詞： ‘琯溪蜜柚； 汁胞粒化； 水楊酸； 木質素

中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0294-05

汁胞粒化是柑橘類果樹常見的一種生理現象。‘琯溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanximiyou]的汁胞粒化是成熟后期和采后貯藏期間發生的生理病害，其主要表現為汁胞異常膨大、變硬，有汁胞木質化，汁味變淡，造成果實食用品質下降，甚至喪失商品價值，給果農帶來很大的經濟損失。潘東明等[1]研究發現‘琯溪蜜柚汁胞在粒化過程中伴隨著細胞壁加厚，纖維、半纖維增多，高爾基體增加，核體積增大，并且粒化汁胞會出現多核仁現象。木質素是由木質素單體經氧化耦合形成的化合物，其氧化過程主要發生在次生加厚的細胞壁[2-3]。Ilan等[4]觀察到柚汁胞粒化與汁胞細胞的木質化有直接關系，但與汁胞中木質素合成的關系尚未明確。

木質素單體的合成主要經過苯丙酸途徑進行，包括了子系列的酶促反應和羥基化、甲基化及還原反應，最終生成3種單體物質[2]，合成的木質素單體被過氧化物酶或者漆酶氧化成木質素[3， 5-6]。木質素生物合成途徑的關鍵酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過氧化物酶（POD）等[7]。在枇杷中的研究發現，水楊酸（salicylic acid，SA）能抑制低溫貯藏過程中PAL、CAD和POD的活性[8]。潘東明等[9]研究表明KT、2，4-D、NAA等能抑制汁胞粒化的發生和發展，但未見SA抑制柚汁胞粒化發生的報道，且SA與木質素合成的關系尚不明確。我們擬用SA處理成熟的‘琯溪蜜柚果實，探討在貯藏過程中，木質素的合成與汁胞粒化的關系，以及外源激素SA如何影響木質素的合成與汁胞粒化的發生。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料采自福建省漳州市平和縣新橋鎮小溪村大坑果園內1株30 a樹齡的‘琯溪蜜柚樹，于成熟期采果，每個處理60個果，采收后立即送至實驗室。預冷的‘琯溪蜜柚果實分別采用0.5 g·L-1（SA1）、1.0 g·L-1（SA2）和1.5 g·L-1（SA3）水楊酸（SA）浸果60 min處理，然后晾干，裝入保鮮袋；以不浸泡處理為對照，均置于7 ℃下貯藏。貯藏過程中每20 d取出部分果實用于試驗，各處理均設置3次重復。

觀察‘琯溪蜜柚果的粒化情況，記錄粒化指數，并從中隨機取粒化和未粒化的汁胞用于木質素含量和相關酶活性的測定。

1.2 方法

1.2.1 ‘琯溪蜜柚粒化指數的統計 果實粒化程度用粒化指數表示，按照潘東明等[1]的方法統計。

1.2.2 汁胞木質素含量的測定 參照鞠志國[10]的方法，取3.5 g汁胞加入10 mL沸水，冷卻后加入86% H2SO4 25 mL，室溫下充分攪拌水解4 h，后加入蒸餾水250 mL，加熱煮沸1 h，冷卻后用預先烘干至恒質量的G4砂心漏斗抽濾，再用蒸餾水洗滌，洗滌液用10% BaCl2檢查，以不出現BaSO4沉淀為止，G4砂心漏斗烘干后稱重。

1.2.3 汁胞PAL活性的測定 參照Cheng等[11]的方法，并略作修改。

PAL的提取： 取1 g汁胞于研缽中，并加入少量的提取介質，冰浴研磨成勻漿，攪勻，10 000 ×g離心15 min。上清液即為待測酶液。

PAL的測定： 反應體系含1.0 mL酶液、0.02 mol·L-1的L-苯丙氨酸1.0 mL和0.05 mol·L-1 pH 8.8硼酸緩沖液2 mL，總體積為4.0 mL。反應液于290 nm測其吸光值，以反應液1 h變化0.001吸光值為1個酶活性單位，PAL活性以U·g-1 FW表示，重復測定3次。

1.2.4 汁胞CAD 活性的測定 參照Goffner等[12]的方法。反應液含有0.2 mL酶提取液，6.4 mmol·L-1的NADP 1.25 mL， 3.2 mmol·L-1的松柏醇1.25 mL，pH 6.5磷酸緩沖液1.3 mL，總體積4.0 mL。于340 nm處測定其吸光值，以1 min變化0.001吸光值為1個酶活性單位，CAD活性以U·g-1 FW表示，測定3次重復。

1.2.5 汁胞 POD活性的測定 參照Meloni等[13]的方法測定。

酶液提取： 稱取汁胞樣品1 g，加入5 mL 50 mmol·L-1 pH 7.0 PBS（含10%PVP），冰浴研磨，于15 000×g低溫4 ℃離心20 min，取上清液供POD測定用。每個樣品重復3次。

POD活性測定： 參照Meloni等[13]的方法。反應混合液由0.2 mol·L-1 PBS （pH 6.0） 50 mL、H2O2 （30%） 0.028 mL和愈創木酚0.019 mL混合而成。測定時取10 μL酶液加反應混合液3 mL混勻，參比為50 mmol·L-1 pH 7.0 PBS 10 μL加反應混合液3 mL混勻，測定A470值，靜置5 min后，再測A470的值，并計算差值。POD活性以ΔA470 ·min-1·g-1表示（鮮質量計）。

POD活性按下式計算：

POD活性=（ΔA470 VT）/（0.01WF·V1·T）

以每分鐘ΔA470變化0.01為1個POD活性單位（U）。VT表示提取液總體積（mL）；V1表示測定時用去酶液體積（mL）；T表示反應時間（min）。

2 結果與分析

2.1 ‘琯溪蜜柚貯藏期間粒化指數的統計

在貯藏過程中，各處理的汁胞粒化指數均隨著貯藏期的延長而逐漸上升（圖1）。在貯藏40 d前，對照組和0.5 g·L-1 SA處理的粒化指數顯著上升，而1.0 g·L-1和0.5 g·L-1 SA處理的汁胞粒化指數無顯著差異，貯藏40 d后，汁胞粒化指數顯著升高，不同濃度SA處理的柚果汁胞粒化指數均顯著低于對照，其中1.0 g·L-1 SA處理能較好地減少汁胞粒化的發生。

2.2 ‘琯溪蜜柚貯藏期間汁胞木質素含量的變化

對照處理和SA處理的‘琯溪蜜柚在貯藏40 d后汁胞木質素的含量均顯著升高。在采后貯藏40 d至60 d期間，各處理的木質素含量急劇增加，但SA處理能顯著減緩蜜柚汁胞木質素含量的升高，其中1.0 g·L-1 SA處理的效果最顯著（圖2）。結果表明，貯藏期間隨著木質素的積累，汁胞木質化程度隨之升高，木質素含量的增加與粒化指數的變化呈顯著正相關，相關系數為0.943，說明汁胞粒化可能是由木質素累積到一定量后引起的生理變化，SA能減少木質素的合成，降低粒化指數。

2.3 ‘琯溪蜜柚貯藏期間木質素合成相關酶活性的測定

圖3表明，各處理的‘琯溪蜜柚在貯藏過程中，汁胞PAL活性呈先上升后下降的趨勢。貯藏20～40 d期間，對照組的PAL活性顯著上升，且顯著高于同時期的SA處理，在貯藏第40天出現PAL活性高峰，之后顯著下降；在此期間（貯藏20～60 d）SA處理的PAL活性呈上升趨勢，在貯藏60 d后0.5 g·L-1 SA處理組的PAL活性達到高峰，而后下降；1.0 g·L-1和1.5 g·L-1 SA處理組的PAL活性在貯藏第80天出現高峰，而后略有下降，處理說明SA處理能降低汁胞PAL活性且延緩其峰值的出現。

由圖4可以看出，不同處理的‘琯溪蜜柚在貯藏過程中，汁胞CAD活性均逐漸上升。對照組在貯藏20～60 d，活性顯著上升，并高于SA處理，而SA處理的CAD活性在貯藏40～60 d才出現顯著升高的變化，說明適宜濃度的SA處理能顯著降低汁胞CAD的活性。結果表明，果實在貯藏期間CAD活性的變化與木質素的合成呈顯著正相關，相關系數為0.981。

由圖5可以看出，各處理組的‘琯溪蜜柚汁胞POD活性在貯藏期間逐漸上升。貯藏前20 d，對照組的POD活性即出現顯著升高的現象，而SA處理組的POD活性無顯著變化，貯藏20 d后POD活性才顯著上升。SA處理果的POD活性及其上升速度顯著低于對照，其中1.0 g·L-1 SA抑制POD酶活性的效果最佳。

研究結果表明，在‘琯溪蜜柚的貯藏過程中，木質素生物合成關鍵酶PAL、CAD和POD的活性與木質素的含量和汁胞的粒化程度有相關性；適宜濃度的外源激素SA處理能夠抑制PAL、CAD的生物合成過程。

3 討 論

研究表明，汁胞粒化與木質素有關。Shomer等[14]認為汁胞粒化是汁胞木質化形成厚壁組織的結果，通過對粒化汁胞的解剖，觀察到囊壁細胞的次生木質壁內鑲物和復飾物的木質化造成了粒化現象[15]，本研究結果表明，木質素含量與汁胞粒化指數呈顯著正相關，進一步證明了木質素的生成是汁胞木質化的主要原因之一。

在木質素合成途徑中，PAL是苯丙氨酸途徑的第1個關鍵酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，最后形成木質素的酚類前體，是一個限速酶，CAD催化松柏醛形成木質素單體[16]，POD則將可溶性的木質素單體氧化聚合成不溶性的木質素聚合體，抑制這3種酶的活性能夠抑制木質素的生成[17]。本研究結果表明，‘琯溪蜜柚在貯藏期間，PAL、CAD和POD與木質素合成密切相關，SA能顯著抑制木質素合成關鍵酶PAL、CAD和POD的活性，從而抑制木質素的合成。

SA是植物內普遍存在的一種酚類化合物[18]，被認為是一種植物內源信號分子和新的植物激素，能夠干擾赤霉素（GA）的信號傳導或響應，從而抑制細胞木質素合成相關酶基因的表達，進而影響植物的生長[19]。吳錦程等[20]用1.0 g·L-1 SA處理貯藏期間的枇杷果實，試驗結果證明外源SA能顯著抑制PAL、PPO、CAD和POD的活性，降低果實木質素含量，減緩果實的木質化。在本研究中，外源SA能顯著抑制貯藏期間‘琯溪蜜柚粒化指數的上升，其原因可能是外源SA抑制了木質素合成途徑中相關基因的表達，因此表現為SA處理組的相關酶活性顯著低于對照組，減少木質素的生成，減輕汁胞木質化程度。

4 結 論

‘琯溪蜜柚采后貯藏期間汁胞粒化程度與汁胞中木質素含量有直接的關系，SA對汁胞粒化的抑制是通過抑制木質素合成途徑中關鍵酶的活性，以減少木質素的合成，從而減輕汁胞粒化的程度。

參考文獻 References：

[1] PAN Dong-ming， ZHENG Guo-hua， CHEN Gui-xin， SHE Wen-qin， GUO Zhi-xiong， SHI Mu-tian， LIN Hui-ying. Analysis of the reasons caused granulation of juice sacs in Guanximiyou pomelo variety[J]. Journal of Fruit Science，1999， 16： 202-209.

潘東明，鄭國華，陳桂信，佘文琴，郭志雄，施木田，林慧穎. 琯溪蜜柚汁胞粒化原因分析[J]. 果樹科學，1999，16（3）： 202-209.

[2] BOERJAN W， RALPH J， BAUCHER M. Lignin biosynthesis[J]. Annual Review of Plant Biology， 2003， 54： 519-546.

[3] RALPH J，LUNDQUIST K， BRUNOW G， LU F， KIM H， SCHATZ P F， MARTIA J M， HATFIELD R D， RALPH S A， CHRISTENSEN J H. Lignins： natural polymers from oxidase coupling of 4-hydroxyphenylpropanoids[J]. Phytochemistry Reviews， 2004， 3： 29-60.

[4] ILAN S， EDO C， ROSA V， ELLA L， MONICA B. Scierification of juice sacs in pummelo （Citrus grandis） fruit[J]. Canadian Journal of Botany， 1989， 67（3）： 625-632.

[5] MCCAIG B C， MEAGHER R B， DEAN J F D. Gene structure and molecular analysis of the laccase-like multicopper oxidase （LMCO） gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Planta， 2005， 221： 619-636.

[6] AYMERICK E， ANTHE G， PURBA M， JIN S K， BRIGITTE P， PETER I B. Biosynthesis and incorporation of side-chain-truncated lignin monomers to reduce lignin polymerization and enhance saccharification[J]. Plant Biotechnolgoy Journal， 2012， 10： 609-620.

[7] VANHOLME R， DEMEDTS B， MORREEL K， RALPH J， BOERJAN W. Lignin biosynthesis and structure[J]. Plant Physiology，2010， 153： 895-905.

[8] CAI Chong. Regulation of lignification and quality changes in postharvest loquat fruit[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2009.

蔡充.枇杷果實采后木質化與品質調控[D].杭州： 浙江大學，2006.

[9] PAN Dong-ming， CHEN Gui-xin， ZHENG Guo-hua， LIN Hui-ying， SHE Wen-qin. Effects of growth regulators on juice sac granulation in pummel fruits[J]. Journal of Fujian Agricultural University， 1998， 27（2）： 155-159.

潘東明，陳桂信，鄭國華，林慧穎，佘文琴. 植物生長調節劑對琯溪蜜柚汁胞粒化的影響[J]. 福建農業大學學報，1998，27（2）： 155 -159.

[10] JU Zhi-guo. Effects of harvest date on phenolics metabolism and tissue browning of laiyang chili（pyrus bretschneideri Rehd）[J]. Scientia Agricultura Sinica， 1991， 24（2）： 63-68.

鞠志國. 采期對萊陽茌梨酚類物質代謝和組織褐變的影響[J]. 中國農業科學，1991，24（2）： 63-68.

[11] CHENG G W， BREEN P J. Activity of phenylalanine ammonia-lyase （PAL） and concentrations of anthocyanins and phenolics in developing strawberry fruit[J]. Journal of American Society for Horticultural Science， 1991， 116（5）： 865-869.

[12] GOFFER D， JODDROY J， GRIMA P J， HALPIN C， KNIGHT M E， SCHUCH W， BOUDET A M. Purification and characterization of isoforms of cinnamyl alcohol denydrogenase from Eucalyptusxylem [J]. Planta， 1992， 188（1）： 48-53.

[13] MELONI D A， OLIVA M A， MARTINEZ C A， CAMBRAIA J. Photosynthesis and activity of superoxide dismutase， peroxidase and glutathione reductase in cotton under salt stress[J]. Environmental and Experimental Botany， 2003， 49： 69-76.

[14] SHOMER I， CHALUTZ E， VASILIVER R， LOMANIEC E， BERMAN M. Scierification of juice sacs in pummelo （Citrus grandis） fruit[J]. Canadian Journal of Botany， 1989， 67（3）： 625-632.

[15] SHE Wen-qin. An analysis on physiological changes and gene differential expressions in the process of pummelo fruit[Citrus grandis （L.） Osbeck] juice sac granulation[D]. Fuzhou： Fujian Agricultural and Forestry University，2009.

佘文琴. 琯溪蜜柚汁胞粒化過程中生理變化與基因差異表達分析[D]. 福州： 福建農林大學， 2009.

[16] BAUCHER M， PETIT-CONIL M， BOERJAN W. Lignin： genetic engineering and impact on pulping[J]. Critical Review Biochemistry Molecular Biology， 2003， 38： 305-350.

[17] VANHOLME R， MORREEL K， RALPH J， BOERJAN W. Lignin engineering[J]. Current Opinion in Plant Biology，2008，11： 278-285.

[18] AN C F， MOU Z L. Salicylic acid and its function in plant immunity[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2011， 53（6）： 412-428.

[19] LINA G G， LUIS E T， LISA A J， RICHARD A D. Salicylic acid mediates the reduced growth of lignin down-regulated plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA， 2011， 108（51）： 20814-20819.

[20] WU Jin-cheng， CHEN Qun， TANG Chao-hui， XIA Hai-lin. Effects of exogenous salicylic acid on lignification and related enzymes activities of loquat during cold storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering， 2006， 22（7）： 175-179.

吳錦程，陳群，唐朝暉，夏海琳. 外源水楊酸對冷藏枇杷果實木質化及相關酶活性的影響[J]. 農業工程學報，2006，22（7）： 175-179.