高遷移率族蛋白N2抑制口腔鱗狀細胞癌增殖作用的體外研究

董小倩　劉西茜　張永紅等

[摘要] 目的 以人口腔鱗狀細胞癌細胞株Tca8113為實驗模型，初步探討高遷移率族蛋白N2（HMGN2）抗口腔鱗

狀細胞癌的作用。方法 大量培養重組人HMGN2表達載體大腸桿菌BL21，用異丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG）誘導HMGN2的表達，產物用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit進行純化。在細胞培養基中加入不同質量濃度的HMGN2，通過MTT、Hoechst 33342熒光染色、流式細胞術和Western-blot法檢測其凋亡效果及抗凋亡的分子機制。結果 經MTT檢測證明HMGN2能顯著抑制Tca8113細胞的生長，通過Hoechst 33342熒光染色、流式細胞術和Western-blot檢測證明HMGN2能使Tca8113的細胞形態發生改變，并且能使Tca8113細胞阻滯于細胞周期的S期，促進Tca8113細胞凋亡。結論 HMGN2可以促進人口腔鱗狀細胞癌細胞的凋亡。

[關鍵詞] 高遷移率族蛋白N2； 人口腔鱗狀細胞癌細胞株； 凋亡

[中圖分類號] R 730.5 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.022 高遷移率族蛋白N2（high mobility group chro-

mosomal protein N2，HMGN2）屬于高遷移率族蛋白

（high mobility group chromosomal protein，HMG）三大家族成員之一，是一種進化保守的非組蛋白，在脊椎動物和非脊椎動物的細胞核中含量非常豐富[1]；其相對分子質量約為9.2×103，由90個氨基酸殘基組成[2-3]。學者們[4-5]在人淋巴因子激活殺傷細胞（lym-phokine-activated killer cell，LAKC）和人宮頸液中分離純化抗菌肽的過程中發現，HMGN2在體外有較強的抗革蘭陰性菌和抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）活性。通過基因雜交的方法發現HMGN2多基

因家族中的功能基因僅有1個，位于染色體1p36。有研究[3]發現：1p區域具有多個腫瘤抑制基因，且1p36

區域的染色體異常與多種腫瘤的發生有關，由此推測HMGN2可能具有抗腫瘤活性。本文主要研究其體外抗人口腔鱗狀細胞癌的功能。

1 材料和方法

1.1 材料

重組人HMGN2表達載體大腸桿菌BL21、人口腔

鱗狀細胞癌細胞株Tca8113（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室保存）。B-PER GST Fusion Protein Purification Kit（Thermo公司，美國）、BCA Protein

AS Say Kit（Pierce公司，美國），改良型RPMI1640培養基（Hyclone公司，美國），新生牛血清（上海復蒙基因生物科技有限公司），MTT（Amreesco公司，美國），Hoechst 33342（Sigma公司，美國），Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、全蛋白試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。

1.2 HMGN2蛋白的分離純化及其質量濃度的測定

將重組人HMGN2表達載體大腸桿菌BL21接種

于固體Luria-Bertani（LB）培養基中培養，挑選單個菌落接種于10 mL LB液體培養基中，37 ℃振蕩過夜；以1∶1 000的體積比接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩6 h后加入異丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside，IPTG）誘導過夜，離心收集細菌，每克菌加入3 mL含苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）的裂解液，冰上裂解20 min，超聲破碎菌體，4 ℃、1.4×104 r·min-1離心20 min，收集上清液過濾，過濾后的樣品經B-PER GST Fusion Protein Purification Kit進行純化，收集HMGN2蛋白并保存。按照試劑盒說明書描述的方法，采用BCA法測定蛋白質質量濃度。

1.3 HMGN2蛋白對Tca8113細胞增殖的抑制作用

1.3.1 細胞培養 Tca8113細胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培養基置于37 ℃、5%CO2孵箱內培養。待細胞匯合達80%以上時用胰蛋白酶消化，離心收集細胞，RPMI1640培養基重懸。

1.3.2 HMGN2蛋白對Tca8113細胞增殖的抑制作用 將消化好的Tca8113細胞以每孔1×104個的密度接種于96孔板中，待細胞貼壁后棄去原培養基，PBS洗2次。用無血清培養基稀釋HMGN2至不同的質量濃度，分別為0、1、2、2.5、3、4、5 μg·mL-1，每個質量濃度設5個平行復孔，將HMGN2與Tca8113細胞共培養，37 ℃作用2～3 h后再加含體積分數為20%血清的培養基，培養48 h后用MTT法于酶標儀上測定光密度（optical density，OD）值。以HMGN2的質量濃度為橫軸，OD值為縱軸作圖，比較各組細胞的生長情況。

1.3.3 HMGN2蛋白對Tca8113細胞生長及形態的影響 將消化好的Tca8113細胞以每孔5×104個的密度接種于24孔板中，細胞貼壁后棄去原培養基，PBS洗2次。用無血清培養基稀釋HMGN2至不同的質量濃度，分別為0、1、2、3 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細胞共培養，37 ℃作用2～3 h后加入含體積分數為20%血清的培養基，培養24、48、72、96 h后于光學顯微鏡下觀察細胞的生長情況及形態變化。

1.3.4 Hoechst 33342熒光染色法檢測細胞凋亡 將消化好的Tca8113細胞以每孔5×104個的密度接種于24孔板中，細胞貼壁后棄去原培養基，PBS洗2次。用無血清培養基稀釋HMGN2至不同的質量濃度，分別為0、1、2、3 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細胞共培養，37 ℃作用2～3 h后加入含體積分數為20%血清的培養基，孵育24 h后吸盡每孔的培養基，PBS洗2次后加入4%多聚甲醛200 μL固定3～5 min，PBS洗2次，加入200 μL質量濃度為10 μg·mL-1的Hoechst 33342，避光反應30 min，PBS洗2次后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率 將消化好的Tca8113細胞以每孔5×105個的密度接種于6孔板中，細胞貼壁后棄去原培養基，PBS洗2次。用無血清培養基稀釋HMGN2至不同的質量濃度，分別為0、1、2、3 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細胞共培養，37 ℃作用2～3 h后加入含體積分數為20%血清的培養基，24 h后收集細胞檢測細胞凋亡，操作按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。

1.3.6 HMGN2蛋白對Tca8113細胞周期的影響 將消化好的Tca8113細胞以每孔5×105個的密度接種于6孔板中，細胞貼壁后棄去原培養基，PBS洗2次。用無血清培養基稀釋HMGN2至不同的質量濃度，分別為0、1、2、3 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細胞共培養，37 ℃作用2～3 h后加入含20%血清的培養基，培養24 h后收集細胞，流式細胞術檢測細胞周期，操作按細胞周期檢測試劑盒說明書進行。

1.3.7 Western-blot法檢測Tca8113細胞凋亡蛋白的表達 取2瓶生長良好的Tca8113細胞，棄去原培養基，PBS洗2次。用無血清培養基稀釋HMGN2至不同的質量濃度，分別為0、2 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細胞共培養，37 ℃作用2～3 h后加入含體積分數為20%血清的培養基。24 h后收集細胞，檢測凋亡蛋白的表達，按試劑盒說明書提取細胞總蛋白，然后用Western-blot法檢測內參照磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）、P53、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達。抗體采用鼠抗GAPDH（1∶1 000）、兔抗P53（1∶500）、兔抗Bax（1∶500）、兔抗Bcl-2（1∶500）、兔抗Caspase-3（1∶500）。

1.3.8 統計學處理 以SPSS 13.0統計軟件處理數據，統計方法采用方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 HMGN2蛋白對Tca8113細胞增殖的抑制作用

不同質量濃度HMGN2作用后的細胞增殖情況見

組的差異即有統計學意義（P<0.01），隨著HMGN2質量濃度的增加，其抑制作用逐漸增強。

2.2 HMGN2蛋白對Tca8113細胞生長及形態的影響

不同質量濃度的HMGN2作用后培養不同的時間，Tca8113細胞的生長情況和形態變化見圖2：與對照組（0 μg·mL-1）相比，1 μg·mL-1 HMGN2組的細胞數量即出現明顯減少；隨著HMGN2質量濃度的增加，細胞數量減少更為明顯，HMGN2的抑制作用逐漸增強；同時可見細胞形態異常，出現核濃縮、碎裂，有凋亡小體形成。隨著HMGN2質量濃度和培養時間的增加，細胞逐漸死亡。

2.3 Hoechst 33342熒光染色法檢測細胞凋亡

Hoechst 33342熒光染色法檢測結果見圖3：對照組（0 μg·mL-1）細胞核基本不著色，HMGN2組細胞呈

強熒光染色，說明HMGN2組細胞膜對Hoechst 33342攝取增高、結合增強，細胞出現凋亡；隨著HMGN2質量濃度的增加，凋亡的細胞逐漸增多；3 μg·mL-1 HMGN2組染色細胞的數量明顯減少，是因為大量細胞死亡，而死亡細胞不被Hoechst 33342染色所致。

2.4 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞

凋亡率

Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測結果見圖4：對照組細胞的早期凋亡率為2.7%，總凋亡率為4.9%；1、2、3 μg·mL-1 HMGN2組的早期凋亡率分別為11.2%、36.9%、59.5%，總凋亡率分別為17.6%、64.7%、77.0%；與對照組比較，細胞的凋亡率隨著HMGN2質量濃度的增加而升高（P<0.05）。

2.5 HMGN2蛋白對Tca8113細胞周期的影響

HMGN2蛋白作用后Tca8113細胞的生長周期檢測結果見圖5：隨著HMGN2質量濃度的增加，S期細胞所占比例逐漸增加，G0/G1和G2/M期細胞的比例逐漸減少，提示HMGN2阻滯Tca8113細胞于S期。

2.6 Western-blot法檢測Tca8113細胞凋亡蛋白的表達

Tca8113細胞經HMGN2蛋白作用后，細胞總蛋白中凋亡促進蛋白Bax和P53表達量增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2和Caspase-3表達量減少（圖6）。該結果提示HMGN2可以導致Tca8113細胞的凋亡。

3 討論

目前HMG蛋白分為三大家族：HMGA、HMGB、HMGN。HMGN2屬于HMGN蛋白亞家族。HMGN蛋白亞家族具有典型的功能結構域即核糖體結合域（nu-cleosomal binding domain，NBD），可將蛋白質錨定于核小體的中心[1]。這類蛋白質包括一個強勢的N-

末端區域，具有對核轉運和核小體結合分別起作用的核定位信號區（nuclear localization signal，NLS）和

NBD[6-7]，具有高度保守的結構，因其C-末端是酸性的，目前認為在利于轉錄的高階染色質結構重排中起著重要的作用[6，8-9]。研究[10-11]顯示，HMGN2可能具有更復雜的功能。Spieker等[3]對25株腫瘤細胞進行

了分析，發現人染色體1p區域具有多個腫瘤抑制基因，如CHD5（chromodomain helicase DNA-binding

protein5）、RUNX3（runt related transcription factor

3）等；1p36這一區域的染色體異常與多種腫瘤的發生有關，HMGN2基因恰恰定位于此，提示該分子可能具有抗腫瘤活性。Porkka等[11]通過實驗證明，HMGN2的N-末端31個氨基酸殘基能結合骨髓上皮原生細胞和腫瘤血管內皮細胞。由此可見，探討HMGN2在腫瘤發生發展中的功能和機制意義重大。

本實驗用MTT法檢測出HMGN2對Tca8113細胞的半數致死量為2 μg·mL-1，因此選擇HMGN2的質量濃度為0、1、2、3 μg·mL-1。經Hoechst 33342熒光染色和流式細胞術檢測發現，HMGN2可促進Tca8113細胞凋亡，且有劑量依賴關系，隨著HMGN2質量濃度的增加，Tca8113細胞的凋亡率也逐漸增高，尤其HMGN2為3 μg·mL-1時，出現了大量的死亡細胞。經細胞周期檢測發現，HMGN2作用于Tca8113細胞后，阻滯其于S期。有文獻[12]報道，沉默ORAOV1（oral

cancer overexpressed 1）基因是通過抑制DNA復制

和調節相關周期蛋白（如cyclin A、cyclin B1和cdc2等）的表達而阻滯Tca8113細胞于S期的。HMGN2對

Tca8113細胞周期阻滯的相關機制仍需進一步的研究。HMGN2主要通過誘導細胞凋亡而殺傷細胞。凋亡主要通過兩條信號通路進行[13-14]，一條是線粒體途

徑即內在途徑，另一條是死亡受體途徑即外在途徑。在內在途徑中，P53通過促進細胞色素C的釋放而導致細胞凋亡；Bcl-2通過抑制細胞色素C的釋放而抑制細胞凋亡；Bax是與Bcl-2位于同一信號通路，但與其作用相反的凋亡促進蛋白。Western-blot檢測結果顯示，HMGN2可以通過內在途徑導致Tca8113細胞凋亡[15]，但具體機制還需進一步的研究。

本研究發現，HMGN2對Tca8113細胞增殖具有明顯的抑制作用。目前治療腫瘤方法如放化療的不良反應較大，HMGN2是存在于人淋巴細胞中的天然蛋白，能在很大程度上減少耐藥性及不良反應，有望作為抗腫瘤藥物用于臨床，但仍需進行深入研究。

[參考文獻]

[1] Bustin M. Regulation of DNA-dependent activities by the func-

tional motifs of the high-mobility-group chromosomal proteins[J].

Mol Cell Biol， 1999， 19（8）：5237-5246.

[2] Hock R， Scheer U， Bustin M. Chromosomal proteins HMG-14 and

HMG-17 are released from mitotic chromosomes and imported in-

to the nucleus by active transport[J]. J Cell Biol， 1998， 43（6）：

1427-1436.

[3] Spieker N， Beitsma M， van Sluis P， et al. An integrated 5-Mb

physical， genetic， and radiation hybrid map of a 1p36.1 region

implicated in neuroblastoma pathogenesis[J]. Genes Chromosomes

Cancer， 2000， 27（2）：143-152.

[4] Feng Y， He F， Zhang P， et al. Inhibitory effect of HMGN2 protein

on human hepatitis B virus expression and replication in the Hep-

G2.2.15 cell line[J]. Antiviral Res， 2009， 81（3）：277-282.

[5] Feng Y， Huang N， Wu Q， et al. HMGN2： A novel antimicrobial

effector molecule of human mononuclear leukocytes[J]. J Leukoc

Biol， 2005， 78（5）：1136-1141.

[6] Bustin M， Reeves R. High-mobility-group chromosomal proteins：

Architectural components that facilitate chromatin function[J]. Prog

Nucleic Acid Res Mol Biol， 1996， 54：35-100.

[7] Bustin M， Lehn DA， Landsman D. Structural features of the HMG

chromosomal proteins and their genes[J]. Biochim Biophys Acta，

1990， 1049（3）：231-243.

[8] Ding HF， Bustin M， Hansen U. Alleviation of histone H1-mediated

transcriptional repression and chromatin compaction by the acidic

activation region in chromosomal protein HMG-14[J]. Mol Cell Biol，

1997， 17（10）：5843-5855.

[9] Trieschmann L， Postnikov YV， Rickers A， et al. Modular structure

of chromosomal proteins HMG-14 and HMG-17： Definition of a

transcriptional enhancement domain distinct from the nucleosomal

binding domain[J]. Mol Cell Biol， 1995， 15（12）：6663-6669.

[10] 韓琴， 鄧璐霞， 趙靜， 等. 小鼠HMGN2干擾質粒psilence-cmv-4.1-

HMGN2構建及體內干擾效果鑒定[J]. 四川生理科學雜志， 2010，

32（1）：5-8.

Han Qin， Deng Luxia， Zhao Jing， et al. Construction and identi-

fication of mouse shRNA psilencer-cmv-4.1-HMGN2[J]. Sichuan

J Physiological Sciences， 2010， 32（1）：5-8.

[11] Porkka K， Laakkonen P， Hoffman JA， et al. A fragment of the

HMGN2 protein homes to the nuclei of tumor cells and tumor en-

dothelial cells in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2002， 99

（11）：7444-7449.

[12] Jiang L， Zeng X， Yang H， et al. Oral cancer overexpressed 1

（ORAOV1）： A regulator for the cell growth and tumor angioge-

nesis in oral squamous cell carcinoma[J]. Int J Cancer， 2008， 123

（8）：1779-1786.

[13] Burz C， Berindan-Neagoe I， Balacescu O， et al. Apoptosis in can-

cer： Key molecular signaling pathways and therapy targets[J]. Acta

Oncol， 2009， 48（6）：811-821.

[14] Roy S， Nicholson DW. Cross-talk in cell death signaling[J]. J Exp

Med， 2000， 192（8）：F21-F25.

[15] Jiang L， Zeng X， Wang Z， et al. Oral cancer overexpressed 1

（ORAOV1） regulates cell cycle and apoptosis in cervical cancer

HeLa cells[J]. Mol Cancer， 2010， 9：20-28.

（本文編輯 吳愛華）