Osterix過表達對人牙周膜細胞骨向分化的影響

趙艷紅　李洪發　王春玲　楊強　鄭朝　付雅麗

[摘要] 目的 研究Osterix（Osx）過表達對人牙周膜細胞受力后骨向分化的影響，探討Osx與正畸牙周組織骨改建的關系。方法 采用組織塊法培養人牙周膜細胞，用重組質粒pcDNA3.1 flag-Osx轉染人牙周膜細胞。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和Western blot方法檢測未轉染組、轉染空質粒組、轉染Osx組細胞Osx mRNA和蛋白表達水平；并觀察核心結合因子α1（Cbfα1）、堿性磷酸酶（ALP）、骨橋素（OPN）、骨鈣素（OC）、骨涎蛋白（BSP）和a1（Ⅰ）型膠原蛋白（Col Ⅰ）的mRNA表達情況。3組細胞加載6 h離心力后，觀察上述檢測指標的變化。結果 轉染24 h后，相對未轉染組，轉染空質粒組Osx mRNA和蛋白水平無明顯變化（P>0.05）；而轉染Osx組Osx mRNA和蛋白表達水平明顯升高（P<0.01），同時5個成骨標志基因的mRNA表達亦均明顯升高（P<0.05，P<0.01）。加力6 h后，3組Osx和成骨標志基因表達水平均明顯升高，但是轉染Osx組Osx mRNA和蛋白表達增強更加顯著，增加量約為其他兩組的2倍，其ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ的mRNA表達亦升高更顯著。結論 Osx過表達可以促進人牙周膜細胞在機械力作用下向成骨樣細胞分化。Osx可能通過調控多種成骨基因的表達，從而在正畸牙周組織的骨改建過程中發揮著重要的作用。

[關鍵詞] Osterix； 過表達； 人牙周膜細胞； 機械刺激； 成骨分化

[中圖分類號] Q 78 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.021

牙周膜細胞在機械力的誘導下分化為成骨細胞[1]，參與骨吸收和骨形成，是正畸骨改建的關鍵。牙周膜細胞通過特定的信號轉導途徑對機械力作出反應，引發一系列細胞生物學反應。此過程涉及多種信號轉導通路，近年來少數研究[2-4]發現：一些核內轉錄因子參與了牙周膜細胞內調控途徑，在將細胞外物理或機械刺激轉化為協調的細胞反應方面發揮著積極的調控作用。

Osterix（Osx）是近年來發現的一種含有鋅指結構的骨形成轉錄因子，它是成骨細胞分化和骨形成不可缺少的一個關鍵調節因子，是間充質細胞向成骨細胞分化所必需的[5]。近年來少量研究[5-7]發現：Osx在牙胚、造釉細胞瘤牙源性組織中均有陽性表達，表明Osx可能在牙齒、牙周組織的發育中發揮著重要的作用。筆者前期實驗已經證實了在體外機械力作用下人牙周膜細胞內Osx mRNA和蛋白的表達增強，參與細胞的成骨分化[8]。本實驗進一步開展了Osx質粒轉染實驗及后續加載實驗，旨在檢測多種成骨標志基因表達的變化，從而進一步明確人牙周膜細胞受力后骨向分化過程是否通過Osx信號通路，并探討Osx在此過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

質粒pcDNA3.1 flag-Osx（由美國Tufts大學牙科學院口腔生物研究所惠贈），質粒小提試劑盒、限制性內切酶（Hind Ⅲ、BamH Ⅰ和Xba Ⅰ）、DNA Marker

（大連寶生物工程有限公司），胰蛋白胨、酵母提取物（Merck公司，德國），DMEM培養基（高糖）、胰蛋白酶、瓊脂（Sigma公司，美國），LipofectamineTM2000

轉染試劑盒（Invitrogen公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），Trizol（上海Sangon生物工程技術服務有限公司），cDNA反轉錄試劑盒（Fermentas公司，美國），Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ（Roche Applied Science公司，德國），山羊抗人、鼠Osx多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），0.45 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluorid，PVDF）膜（Amersham Bio-sciences公司，瑞典）。

IXZ-ILL100型倒置相差顯微鏡、CX71顯微鏡及照相系統（OLYMPUS公司，日本），CO2細胞培養箱、

臺式冷凍高速離心機（Heraeus公司，德國），梯度聚

合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（Bio-metra公司，德國），電泳槽、電泳儀、電轉儀、制膠器（BIO-RAD公司，美國）。

1.2 人牙周膜細胞的原代培養和鑒定

取11～14歲青少年因正畸而拔除的牙周健康的前磨牙。采用組織塊法原代培養人牙周膜細胞，取第2代細胞爬片，用免疫組化SP法進行波形絲蛋白和角蛋白染色，進行來源鑒定。

1.3 人牙周膜細胞的體外轉染

1.3.1 重組質粒pcDNA3.1 flag-Osx的初步鑒定 利用限制性內切酶對pcDNA3.1 flag-Osx進行酶切鑒定。按照試劑盒說明，分別利用限制性內切酶Hind Ⅲ建立單酶切鑒定體系，利用限制性內切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ建立雙酶切鑒定體系，混勻后37 ℃水浴2～3 h。取10 μL上述酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統上觀察電泳圖譜，最終確定是否轉化成功。

1.3.2 轉染人牙周膜細胞 取生長狀態良好的第2～3代人牙周膜細胞，按照每孔2.5×105個接種于6孔細胞培養板。待細胞融合至80%時，按陽離子脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明操作，用重組質粒pcDNA3.1 flag-Osx和空載體質粒pcDNA3.1 flag轉染人牙周膜細胞。轉染4～5 h后移去轉染液，加入DMEM完全培養液繼續培養，分別于培養后24、48、72 h收集細胞，檢測轉染后不同時間點Osx基因和蛋白表達情況，并選取培養24 h的細胞進行后續加力實驗。

1.4 人牙周膜細胞的體外加力

本研究參照以往的報道[9]，采用離心加力法對

細胞加載機械力。將分別種有無轉染、轉染空質粒（pcDNA3.1 flag）、轉染目的基因（pcDNA3.1 flag-

Osx）3組細胞的6孔板在無菌條件下用無菌密封膠密封，置于37 ℃離心機加力支架中，以離心機加力（631 r·min-1，約80 g相對離心力）6 h。此加力方式相當于對人牙周膜細胞施加接近正畸臨床的持續壓力，大小約為16 g·cm-2，屬于正畸臨床輕力范圍[8]。

1.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-poly-

merase chain reaction，RT-PCR）

采用Trizol法提取細胞總RNA，并進行質量測定。應用cDNA反轉錄試劑盒建立反應體系，離心混勻后置于循環變溫加熱器進行反轉錄。反應條件為：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。生成的cDNA置冰上進行后續實驗或保存于-20 ℃備用。

取2 μL cDNA，采用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ建立反應體系，放入LightCy-

cler機器內，按照實驗說明進行實時定量PCR。反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸5 s，循環45次。融解分析產物特異性，電泳鑒定產物大小。以β-actin作為內參照，用LightCycler Software Ver. 4.0分析目的基因的相對表達水平。本實驗中，除了檢測Osx mRNA的表達外，同時還檢測了核心結合因子α1（core-binding fac-tor α1，Cbfα1），成骨標志基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨橋素（osteopontin，OPN）、骨

鈣素（osteocalcin，OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和a1（Ⅰ）型膠原蛋白（collagen protein a1，ColⅠ）mRNA的表達，以反應細胞的成骨分化情況。其中所用基因引物序列具體見表1。

1.6 Western blot檢測Osx蛋白的表達

收集細胞約5×106個，冰上加入適量（200 μL）細胞裂解液（50 mmol·L-1 Tris-HCl、150 mmol·L-1 NaCl、1%Triton X-100、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸、10%丙三醇、0.5 mmol·L-1苯甲基磺酰氟化物、10 μg·mL-1亮肽酶素和1 μg·mL-1抑酞酶），裂解細胞，低溫離心，獲取全蛋白上清，-80 ℃保存備用。采用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。

取等量蛋白樣品，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），后將蛋白帶轉移到PVDF膜上，封閉液封閉，加入山羊抗人、鼠Osx多克隆抗體（1∶250）4 ℃過夜，漂洗后加入用TBS稀釋

的辣根酶標記兔抗山羊二抗（1∶2 500），搖動反應1～2 h進行雜交，顯色。實驗以actin作為內參照，應用JD801圖像分析系統測定目的條帶的相對積分光密度，分析Osx蛋白表達水平。

1.7 統計學分析

采用SPSS 12.0統計軟件包對數據進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 人牙周膜細胞的體外培養和鑒定

倒置顯微鏡下觀察可見，牙周膜組織塊在5～10 d內開始有細胞游出，以組織塊為中心呈放射狀排列生長，20 d爬滿培養瓶。人牙周膜細胞呈長梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，胞核呈圓形或卵圓形。傳代后細胞生長旺盛，性狀穩定，具有成纖維細胞特性。免疫細胞化學檢測結果為抗波形絲蛋白陽性、抗角蛋白陰性（圖1）。

2.2 表達載體pcDNA3.1 flag-Osx的酶切鑒定結果

對提取的表達載體pcDNA3.1 flag-Osx進行酶切鑒定，凝膠電泳觀察結果見圖2。由圖2可見，得到的目的片段與預期片段大小一致：pcDNA3.1 flag-Osx經Hind Ⅲ雙酶切得Flag-Osx片段；經BamH Ⅰ和

Xba Ⅰ雙酶切得Osx片段（約1 200 bp）。

2.3 轉染后Osx基因和蛋白表達的檢測

轉染pcDNA3.1 flag-Osx后，分別于24、48、72 h抽提總RNA，采用實時RT-PCR檢測轉染效果。轉染24、48、72 h，Osx mRNA表達均比未轉染時顯著上調（P<0.01），24 h時表達最高，隨后逐漸降低（圖3）。

轉染24 h后，轉染Osx組Osx mRNA表達水平相對未轉染細胞明顯升高28.1倍，同時Osx蛋白亦呈現一個強烈表達（P<0.01）。相反，轉染空質粒組的Osx mRNA和蛋白水平相對未轉染組無明顯變化（P>0.05）。加力6 h后，3組Osx表達水平均明顯升高，但是相對轉染空質粒組和未轉染組，轉染Osx組Osx mRNA和蛋白表達增強更顯著，增加量約為其他兩組的2倍（圖4、5）。

2.4 轉染加力后Cbfα1和成骨標志基因的表達變化

轉染空質粒組與未轉染組相比，Cbfα1及5個成骨標志基因（ALP、OPN、OC、BSP 和Col Ⅰ）的mRNA表達變化無明顯差異（P>0.05）。與未轉染細胞相比，細胞轉染Osx后，Cbfα1 mRNA表達無明顯變化（P>

0.05），但5個成骨標志基因的mRNA表達均明顯升高（ALP、Col Ⅰ為P<0.05，OPN、OC、BSP為P<0.01）。ALP、OPN、OC、BSP和Col ⅠmRNA表達水平分別是未轉染細胞的2.6、3.1、17.6、5.5和2.6倍。加力

6 h后，3組Cbfα1 mRNA的表達無明顯變化，而ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA的表達水平均升高（P<

0.05）。轉染空質粒組與未轉染組相比，細胞受力后5個成骨標志基因變化無明顯差異（P>0.05）；而轉染Osx組與未轉染組相比，受力后ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA表達量升高更顯著（P<0.05）（圖6）。

3 討論

Osx是成骨細胞分化和骨形成不可缺少的調節因子[10]，其調控許多重要的成骨早晚期表型和功能蛋

白的表達[5]。Osx過表達可以抑制C3H10T1/2、C2C12 細胞向原來方向分化，同時激活OC和Col Ⅰ的表達，促使細胞發生成骨分化。而在Osx基因剔除小鼠胚胎中，各種成骨分化標志物的表達水平嚴重降低或缺如，成骨細胞的分化、成熟被完全阻斷[7]。本實驗在

目的質粒轉染及機械加載前后分別檢測了5個成骨標志基因mRNA的表達變化。在成骨分化過程中，ALP是一組膜結合糖蛋白，其活性在成骨分化早期即開始升高，ALP的表達是成骨細胞分化的主要特征之一。OPN是基質礦化的調節基因[11]，OPN mRNA在

成骨細胞分化的早期即開始表達；在牙齒發育中，OPN的表達早于BSP，可以作為成骨樣細胞分化的早期標志。Col Ⅰ是基質礦化支架，通過整合素受體增加成骨細胞黏附能力和發揮促分化作用[12]。BSP是羥

磷灰石結合形成的起始位點[13]，可以刺激細胞的增

殖，并促進前成骨細胞分化為骨細胞。BSP的表達早于OC，在成熟晚期即開始表達。OC是細胞外基質蛋白，它是成骨細胞成熟的標志[14]，OC mRNA表達在礦化期開始，并逐漸達到高峰。

本實驗轉染空質粒組與未轉染組相比，ALP、OC、OPN、Col Ⅰ和BSP mRNA表達未出現變化，排除了脂質體轉染后對實驗結果的影響。轉染目的基因Osx后，Osx過表達未改變Cbfα1基因的表達，與以往研究結果相一致，這可能是因為Osx位于Cbfα1下游發揮作用[5]；但Osx過表達顯著增強了ALP、OPN、BSP、OC和Col ⅠmRNA的表達。以往研究已證明Osx單獨作用就足以促使許多重要的成骨細胞分化早晚期標志基因的表達，發生礦化反應[5]。本實驗結果說明Osx過表達通過增強ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ這些成骨標志基因的表達，能夠促進人牙周膜細胞向成骨樣細胞分化，進而合成骨基質，實現礦化成骨。正如Osx過表達能有效誘導鼠胚胎干細胞[15]、骨髓基質細胞[16]等分化為成骨細胞系。OC的顯著上調部

分說明Osx單獨作用即可誘導人牙周膜細胞發生終末成骨分化。由此可以推測，機械力誘導的人牙周膜細胞內Osx高表達同樣也將刺激這些成骨分化早晚期表型和功能基因的表達，推動細胞發生成骨分化。因此，從某種程度上來說，機械刺激誘導人牙周膜細胞的成骨分化需要通過上調Osx的表達來實現。

轉染Osx組與未轉染組相比較，加力作用6 h后，Osx mRNA和蛋白表達進一步增強，ALP、OPN、Col Ⅰ、BSP和OC mRNA表達增強更顯著，實驗結果證明在機械力誘導人牙周膜細胞向成骨樣細胞分化過程中，Osx起著促進作用。機械刺激引起Osx表達增強，進而增強成骨標志基因的表達，從而促進人牙周膜細胞向成骨樣細胞分化，參與牙周組織改建的骨形成和骨吸收。可見，Osx作為一個關鍵的中間環節，在機械力誘導人牙周膜細胞成骨分化過程中發揮著重要的信號級聯放大和轉導調控作用。

體外培養的人牙周膜細胞表達成骨細胞的部分表型特征[17]，機械力單獨作用即可誘導人牙周膜細

胞分化成成骨樣細胞[18]。近來研究表明：核內轉錄

因子參與了細胞內調控途徑，將細胞外物理刺激轉化為協調的細胞內生化反應[2-5]。本研究結果表明Osx可能是一條新的信號傳遞途徑，參與了機械力誘導的人牙周膜細胞成骨分化過程，這對正畸牙齒移動過程中的骨改建具有重要作用。當然，Osx在此過程中是否是必需的以及是如何具體發揮作用的，還需要進一步驗證。牙周膜細胞是一個異質性的細胞群，不僅包含具有分化潛能的成纖維細胞群體，同時包含具有多向分化潛能的未分化的成體干細胞，即牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）。近年來，隨著人PDLSCs的分離成功和研究的不斷深入，發現PDLSCs不僅具有較強的克隆形成能力，而且表達ALP、BSP、OCN等一系列成骨細胞標志物[19]，同時有研究初步證明張應力能夠促進PDLSCs向成骨細胞分化，并推測PDLSCs可能是在機械力作用下成骨細胞分化的主要來源細胞，從而介導骨形成和骨吸收[20]。本研究中機械力加載、Osx過表達誘導的人牙周膜細胞系列成骨基因表達，發生明顯成骨反應，可能與牙周膜細胞中PDLSCs的存在和發揮作用密不可分的。當然，具體的檢測和分析還需要借助進一步的實驗研究。

總之，本研究表明：Osx過表達可促進人牙周膜細胞在機械力作用下向成骨樣細胞分化。Osx可能通過介導和調控多種成骨基因的表達，從而在正畸牙周組織的骨改建過程中發揮重要作用。

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（本文編輯 杜冰）