雙因子誘導軸型支架血管化的組織形態學研究

李受益　蔡慶義　陳剛　朱曉虹　鐘曉敏　彭德瑞

[摘要] 目的 以血管內皮生長因子（VEGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）復合同軸雙層聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）支架并包裹股動靜脈血管束，觀察血管再生與成熟及支架早期血管化的動態變化。方法 將18只3月齡成年

雄性新西蘭大耳兔隨機分為3組：實驗組（8只）、實驗對照組（8只）和空白對照組（2只）。解剖分離兔的股動靜脈血管束，將其包裹于溶液澆鑄-顆粒瀝取法制備的同軸雙層PLGA支架中央。實驗組支架的外層加注PDGF，內層加注VEGF；實驗對照組支架的外層為空白，內層加注VEGF；空白對照組不予特殊處理。實驗組及實驗對照組于支架植入術后第7、10、14、21天觀察新生血管的形態特征，空白對照組于支架植入術后第7、10天觀察作為對照。結果 術后第7天，實驗組及實驗對照組股動靜脈血管束可見少量呈放射狀分布的血管芽；術后第10天，兩組大量的新生血管芽沿支架孔隙空間向內層支架放射狀生長并貫通支架全層，密度由內向外梯度遞減；術后第14天，實驗組血管壁較厚，呈分層結構，實驗對照組以單層內皮樣細胞襯里的幼稚血管為主；術后第21天，實驗組支架內以成熟血管為主，而實驗對照組血管數量明顯減少。空白對照組始終未見明顯血管結構。結論 同軸雙層PLGA支架復合VEGF/PDGF可有效促進早期血管化。

[關鍵詞] 骨組織工程； 血管化； 動靜脈血管束； 血管新生

[中圖分類號] Q 81 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.022

組織工程骨因具有無抗原性、來源不受限制、可預先設計塑形和具有生物功能等獨特優勢，而具有廣闊的發展前景。但如何提高并確保骨組織工程的早期血管化，迄今仍是影響其規模化及實用性的瓶頸之一[1-3]。組織工程血管化的關鍵是功能血管的數量及其營養能力，而不是僅僅在于成功誘導新生血管的總量。真正有實際價值的早期血管化過程，應既能誘導新生血管在支架空間結構內大量增殖，又能在此基礎上進一步促進其結構成熟以形成穩定有效的血循系統[4]。本研究設計同軸雙層聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支

架，將血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）分別復合于內外層支架形成空間差異分布方式，并將股動靜脈血管束包裹于支架中央，觀察支架內部早期誘導血管化的效能及其時間-空間動態變化與轉歸。

1 材料和方法

1.1 同軸雙層PLGA支架的制備

將PLGA（聚乳酸∶聚羥基乙酸為50∶50，相對分子

量50×103，固有黏度0.24 dL·g-1，山東醫療器械研究所）及粒徑150～300 μm的氯化鈉顆粒混勻溶于氯仿，澆鑄于軸型模具[5]內，按溶液澆鑄-顆粒瀝取法[6]制備大小兩套中空管狀支架各18套，套迭形成雙層結構。Co60 25 kGy輻照滅菌，-20 ℃保存。

1.2 股動靜脈血管束分離及支架植入

將18只3月齡成年雄性新西蘭大耳兔（天津醫科大學動物實驗中心提供，體重2.0～2.5 kg）隨機分為3組：實驗組（8只）、實驗對照組（8只）和空白對照組（2只）。全身麻醉下于兔左側大腿內側中份縱行解剖游離股動靜脈血管束，結扎分支，顯露約2.5 cm，包裹于植入體內的同軸雙層PLGA支架的中央管腔內。根據分組，實驗組雙層軸型PLGA支架的外層用微量注射器加注含PDGF 0.5 ng的溶液50 μL，內層加注含VEGF 0.5 ng的溶液50 μL；實驗對照組的支架外層為空白，僅在內層加注含VEGF 0.5 ng的溶液50 μL；空白對照組植入支架不予特殊處理。將支架與毗鄰肌肉縫合固定，分層嚴密縫合。

1.3 標本取材及檢測

實驗組及實驗對照組分別于支架植入后第7、10、14、21天各取2只動物處死，切取包含支架周緣5 mm肌肉組織在內的完整組織塊。-20 ℃直接冰凍包埋后行7 μm切片及蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色，觀察新生血管的形態特征。空白對照組于支架植入術后第7、10天各取1只動物，進行對比觀察。

2 結果

術后第7天，實驗組（圖1A）與實驗對照組（圖1B）表現相近，均可見VEGF誘導下，股動靜脈血管外壁向內層支架多孔間隙內呈放射分布方式，長入條索狀新生組織，周圍植床組織亦可見少量纖維樣組織長入外層支架孔隙，新生組織分布以內、外層支架表淺區域為主。高倍鏡下股動靜脈血管束可見少量由單層內皮樣細胞襯里的幼稚血管芽。空白對照組（圖1C）僅見少量纖維組織，未見明顯血管結構。

術后第10天，實驗組（圖2A、B）、實驗對照組

（圖2C、D）標本可見大量新生血管芽廣泛長入支架

內部，沿支架孔隙空間向內層支架放射狀生長，走行呈迂曲狀，貫穿支架內外全層，血管外周的纖維結締組織基質豐富，新生血管密度由內層支架表面向外梯度遞減。兩組對比可見，實驗組近外層支架

（PDGF）區域內新生血管的管徑較粗且管壁較厚，腔

內聚集血細胞，近內層支架（VEGF）區域內的血管則以單層內皮樣細胞襯里的幼稚血管結構為主，內含少量血細胞；實驗對照組仍多為單層內皮樣細胞襯里的幼稚血管。空白對照組（圖2E）僅見少量纖維組織，未見明顯血管結構。

術后第14天，實驗組（圖3A、B）標本可見雙層支架腔隙內廣泛分布新生血管網絡并貫穿全層，其管壁較厚且結構較成熟圓潤，清晰可見逐步過渡的內、中、外膜分層，同時可見少量幼稚血管。實驗對照組（圖3C、D）則以單層內皮樣細胞襯里、形狀

較不規則的幼稚血管為主，成熟血管相對較少。

術后第21天，實驗組、實驗對照組血管密度均降低，實驗組支架內以成熟血管為主（圖4A），沿新生血管軸的縱剖面尚可見血管芽（圖4B）或豐富分支架構，管腔內含有大量的血細胞，支架內可見少量血細胞。實驗對照組（圖4C、D）管徑較粗的血管數量較實驗組明顯減少，支架內可見大量散逸的血細胞。

3 討論

皮膚、軟骨及角膜等少數組織細胞可通過周圍血管的擴散而得到充分的氧氣和養分[3]。但這種擴散

能力僅限于血管周圍200 μm范圍之內。對于骨、肌肉等較大工程組織的成功應用，血管化問題尚待進一步解決[7]。當組織工程支架植入體內時，雖因手術

創傷引起的炎癥反應和支架內部種子細胞在缺氧條件下釋放的成血管因子可共同誘導支架血管化，但此方式形成血管的速度較慢，無法轉運充分的氧氣和養分至支架內部的種子細胞。因此學者[4]通過改變

支架構型設計、復合誘導血管再生細胞因子、體內外預血管化等方式促進工程組織的血管化進程。

誘導骨組織工程血管化的關鍵是要形成結構成熟、功能穩定、能夠長期提供血運的循環系統，因此，血管新生應包括兩方面：內皮細胞的遷徙、增殖及周細胞維持新生血管芽的穩定[8]。只有依靠早期

形成的有效血循網絡，方可在組織工程支架內，為受控的組織細胞分化增殖及最終形成具有預期形態及功能的組織/器官提供有效的供氧/供養功效。

Richardson等[9]認為VEGF在血管化早期促進血

管新生，PDGF在血管化后期誘導血管成熟，聯合應用這兩種因子將能更好地促進血管的再生與成熟。在組織工程領域，構建一個具有復雜功能的組織，其關鍵是要精確地協調好干細胞所處微循環環境的時間及空間變化。本研究中，將股動靜脈血管束包裹于構建的同軸雙層PLGA支架中央作為軸型血供來源，通過在其外層復合PDGF、內層復合VEGF的設計方式，使兩種分別作用在血管形成不同時期的誘導因子利用空間分布的差異方式，形成對血管組織誘導再生的時間差異效應。VEGF接近股動靜脈，利于早期誘導大量血管芽生及幼稚血管生成。PDGF位居外層，利于促進后期放射狀向外生長，并促進最終與周圍組織血循溝通的新生血管結構的成熟與穩定。事實上，這種后期的血管成熟與穩定，才是真正有意義的支架血管化的組織結構基礎。與此同時，在外層管壁支架上的PDGF，還依賴滲透方式逐步作用于較靠內的新生血管叢，使之最終穩定下來。

本研究結果顯示，實驗組第10天時，隨著兩種因子在雙層支架內部逐漸形成的不同濃度梯度，由外層支架到內層支架可見新生血管由成熟到幼稚。第21天時，實驗對照組新生血管密度較前明顯降低。動靜脈血管束早期在VEGF的誘導下，支架內部形成大量的幼稚血管，這些幼稚血管成熟之前在VEGF的持續作用下可以避免退化及內皮細胞凋亡。但隨著VEGF的逐步降解，新生的幼稚血管急劇退化而大量血細胞殘存于支架內部。實驗組早期在VEGF誘導下大量新生幼稚血管伴隨纖維組織貫穿雙層支架，后期在PDGF作用下，幼稚血管逐漸改建成熟，雖然VEGF和PDGF不斷降解，但僅少部分未成熟的新生血管逐漸退化，最終形成貫通雙層支架內部的成熟穩定的循環網絡。

在VEGF及其他成血管因子的誘導下，內皮細胞釋放基質金屬蛋白酶降解周圍的細胞外基質，內皮細胞增殖并向高濃度因子部位遷徙[10]，內皮細胞遷

徙至降解后形成的腔隙最終形成新生血管。其過程受黏附蛋白、生長因子、連接分子、內源性抑制分子等的聯合作用[11]。新生血管進一步改建為成熟血

管則需要多種功能不同因子之間的相互作用[10]，但

是Greenberg等[12]發現在誘導組織工程血管化過程中

聯合應用VEGF和PDGF并不能獲得持久的血管效應，認為VEGF受體2抑制PDGF受體β信號通路，進而干擾血管平滑肌功能及血管成熟。關于不同因子之間的協調機制，尚須從分子層面及細胞信號通路方面等進一步研究。

本研究表明：同軸雙層PLGA支架構建方式可顯著改善組織工程支架內部的早期血運環境，提高氧氣和養分的輸送效能。

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（本文編輯 李彩）