普洱茶固態發酵過程中多酚氧化酶酶學活性研究

柴 潔，馬存強，周斌星，楊 超，郭 威，任小盈

(云南農業大學龍潤普洱茶學院，云南昆明650201)

普洱茶是以地理標志保護范圍內的云南大葉種曬青毛茶為原料，并在地理標志保護范圍內采用特定的加工工藝制成、具有獨特品質特征的茶葉［1］。按其加工工藝及品質特征，普洱茶分為普洱生茶和普洱熟茶兩種類型。普洱茶的固態發酵工藝是形成普洱茶“醇、厚、甘、滑”等獨特品質的關鍵工序。茶多酚氧化酶(鄰苯二酚氧化還原酶，PPO，E.C.1.10.3.1)是茶樹體內的一種重要酶類，它對茶樹的生長發育具有積極意義，在茶葉加工中占有極為重要的地位，其活性的高低也是決定茶樹品種適制性的一個重要指標［2］。茶葉所有化學成分中，多酚氧化酶與茶多酚有著密切的關系。茶多酚又名茶單寧、茶鞣質，由多種酚類物質組成的羥基酚類化合物，是茶葉的主要呈味物質和生理活性成分。茶多酚是以兒茶素為主體成分，占多酚類物質總量的70%～80%［3］。多酚氧化酶的作用主要是促使兒茶素類物質氧化形成茶黃素、茶紅素和其它的氧化聚合物，同時伴隨兒茶素的氧化，氨基酸、胡蘿卜素等香氣前體發生偶聯氧化，產生各種各樣的香氣化合物［4］。近期的研究表明，普洱茶固態發酵過程中，隨著翻堆次數的增加，兒茶素總含量顯著下降，減幅達70%～90%，特別是酯型兒茶素(ECG、EGCG)的下降趨勢很明顯。普洱茶固態發酵過程中茶多酚是形成普洱茶品質的重要活性物質，在茶湯中呈苦澀味，有較強的刺激性，與普洱茶品質相關系數為0.875［5］，而多酚氧化酶與茶多酚的變化有密切的聯系，因此測定研究普洱茶發酵過程中多酚氧化酶的活性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶原料 臨滄鳳慶大葉種曬青毛茶(2012年4月)，云南昆明茶葉市場;聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、鄰苯二酚、L－脯氨酸、牛蛋白標準液Sigma公司;丙酮、石英砂、尿素、檸檬酸、磷酸氫二鈉、酒石酸鐵 天津市風船化學試劑科技有限公司;表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表兒茶素(EC)、焦性沒食子酸標準品 Sigma公司。

JH752型紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;HH－S28s型數顯恒溫水浴鍋 金壇市環保儀器廠;SKG－02.500型電熱恒溫干燥箱 黃石市恒豐醫療器械有限公司;JR－1003電子天平 上海新諾儀器廠;ABW－1001－U艾科浦超純水機 重慶頤洋企業發展有限公司;KDC－2046低溫大容量離心機 中國科學大學科技實業總公司中佳光電儀器公司;MDF－32V低溫冰箱 日本三洋SANYO公司;PHS－3型精密PH計 上海雷磁儀器廠;Labonce－250TH恒溫恒濕實驗箱 北京蘭貝石恒溫技術有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 取3份曬青毛茶茶樣，每份5000g，采用 GB/T8304－2002［5］120℃烘干法測定毛茶含水量為5.56%，分別添加1620mL蒸餾水使含水量達38%，充分拌勻茶樣，然后將茶樣放置在溫度為30℃、空氣濕度為80%培養箱中發酵，每隔6d翻堆一次，翻堆時取樣品測定蛋白質含量、多酚氧化酶活性以及含水量，水分不足38%時要補水。

1.2.2 粗酶液的制備 發酵茶樣翻堆時取發酵樣0.5g，加不溶性聚乙烯吡咯烷酮0.3g、石英砂2g及適量的預冷的pH5.6檸檬酸磷酸緩沖液，在冰冷的研缽中磨成勻漿，并用上述緩沖液定容至10mL再放置4℃的冰箱浸提12h，并攪拌幾次。過濾后放到低溫超速離心機中以4000r/min離心15min，上清液即為酶制液［6］。

1.2.3 酶活性反應條件研究

1.2.3.1 最適pH的確定 取酶液1mL，加反應混合液3mL，按檸檬酸－磷酸緩沖液(0.1mol/L，pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)∶0.1% 脯氨酸∶1% 鄰苯二酚(10∶2∶3)比例配制成反應液，在 37℃下溫浴10min，立即加1mol/L偏磷酸3mL終止反應，反應結束后測定酶活力，3次平行實驗，求平均值。

1.2.3.2 最適溫度的確定 取酶液1mL，加反應混合液3mL，按0.1mol/L pH5.6檸檬酸－磷酸緩沖液∶0.1%脯氨酸∶1%鄰苯二酚(10∶2∶3)比例配制成反應液，分別在30、37、40、45、50、55、60、65、70、75℃條件下加熱10min，立即加1mol/L偏磷酸3mL終止反應，反應結束后測定酶活力，3次平行實驗，求平均值。

1.2.3.3 最適酶促反應底物 分別配制2mmol/L的EGCG、ECG、EGC、EC 和50mmol/L焦性沒食子酸代替1%鄰苯二酚作為酶促反應底物。取酶液1mL，加反應混合液 3mL，0.1mol/L pH5.6檸檬酸－磷酸緩沖液∶0.1%脯氨酸∶反應底物分別依照 12∶2∶1、11.5∶2∶1.5、11∶2∶2、10∶2∶3 比例建立不同濃度的反應底物反應液，測定不同反應底物不同濃度下的OD值，每組3次平行實驗，求平均值。

1.2.4 分光光度法測定多酚氧化酶活性 取酶液1mL，加反應混合液3mL(反應混合液按0.1mol檸檬酸緩沖液(pH5.6)∶0.1%脯氨酸∶1% 鄰苯二酚 =10∶2∶3 配置)。然后在37℃恒溫水浴鍋中保溫10min，立即加1mol/L偏磷酸偏磷酸3mL終止反應。于460nm波長處，用10mm比色皿比色?？瞻坠苤蟹磻旌弦褐械泥彵蕉佑镁彌_液代替，3次平行實驗，求平均值。酶活性以每克樣每分鐘E460增加0.1為一活性單位。

酶活性(U)=E460/0.1×W×t

式中:W－樣品量(g);t－反應時間(min);E460－反應終止時在460nm處的光密度。

1.2.5 考馬斯亮藍法測定酶蛋白含量

1.2.5.1 蛋白質標準曲線制作 利用0.15mol/L NaCl將標準牛蛋白配制成濃度為0.1mg/mL的蛋白溶液?？捡R斯亮藍溶液配方:取100mg考馬斯亮藍G－250溶解于50mL，95%乙醇溶液中，再加10mL，85%磷酸，用蒸餾水定容到 1000mL。依次取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL 的 0.1mg/mL 蛋白溶液和 0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4mL 的0.15mol/L NaCl溶液與5mL 考馬斯亮藍G－250溶液，用漩渦混勻器震蕩均勻后，在595nm波長處測定吸光度OD值，3次平行實驗，求平均值。得回歸方程:Y=186.24X－13.142，Y為蛋白質濃度(mg/mL)，X為OD值;相關系數R2=0.9966。

1.2.5.2 蛋白質含量計算 取0.1mL粗酶液用0.15mol/L NaCl稀釋10倍。取0.1mL稀釋液采取考馬斯亮藍法在595nm波長處測定吸光度OD值，3次平行實驗，求平均值。通過回歸方程計算粗酶液中蛋白含量。

1.2.5.3 米氏方程 米氏方程表示一個酶促反應的起始速度(V)與底物濃度［S］關系的方程。

V=Vmax［S］/(Km+［S］)

式中:V－反應速率，OD/h;Vmax－最大反應速率，OD/h;［S］－底物濃度，mmol/L;Km－米氏常數，mmol/L。

Km值表示酶促反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度。Km值與pH和溫度有關，而與酶液濃度無關。當Km最小時，一般稱為該酶的最適底物或天然底物。一般通過雙倒數法計算Km和Vmax。以底物濃度的倒數為橫坐標、以酶反應的初速度倒數為縱坐標，利用Line weaver－Burk雙倒數法做圖。

1.2.5.4 多酚氧化酶比活力 酶的比活力是指每毫克或每克酶蛋白所具有的酶活力單位。一般用U/mg或U/g表示。

多酚氧化酶的比活力(U/mg)=每毫升酶液的酶活力(U)/每毫升酶液的酶蛋白質量(mg)

2 結果與討論

2.1 pH對PPO酶活性的影響

不同pH對酶活性的影響如圖1所示。從圖1中可以看出，pH在4.0～5.5之間PPO活性逐漸增大，在pH5.5酶活性達到最大，而在pH大于5.5時，酶活力急劇下降，pH達到7.5時酶活力已不足最大時的一半。因此，多酚氧化酶酶適宜的最適pH為5.5，茶多酚氧化酶是一類含有銅離子在極端pH環境下變性失活的酶［7］。普洱茶固態發酵期間PPO酶促反應的最適pH為5.5，這與普洱茶固態發酵期間pH維持在5～6的弱酸水平相一致［8］。在堿性環境下會破壞酶蛋白的結構，導致多酚氧化酶迅速失活。

圖1 pH對PPO酶活性的影響Fig.1 Effect of pH on activity of PPO

2.2 溫度對PPO酶活性的影響

不同溫度對該酶促反應的影響如圖2所示。從圖2中可以看出，茶多酚對溫度很敏感，其最適溫度為55℃。當溫度＜55℃時，酶活性隨溫度的升高而升高，當溫度為55℃時表現最大活力。但是溫度＞55℃時，隨著溫度溫度的升高，酶活性直線下降。因此，反應的最適溫度為55℃，過高的溫度會使酶蛋白變性，破壞了三維結構導致多酚氧化酶的不可逆失活。

圖2 溫度對酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on activity of PPO

普洱茶固態發酵期間PPO的最適溫度為55℃，而有研究表明［7］茶樹等植物體內多酚氧化酶最適溫度為50℃，兩者存在一定差異［9－11］。這應該與固態發酵的高溫高濕環境以及微生物的參與有關。普洱茶固態發酵期間，由于微生物熱的緣故，葉溫持續升高，維持在50℃以上［12］，PPO的本質為蛋白質大分子，只有在保證其活性部位三維結構的完整性前提下，才能發揮其酶促活性。較低的溫度影響酶與底物結合的速率，過高的溫度破壞酶的活性部位，甚至造成不可逆失活［9］。因此，溫度對PPO具有篩選作用。

2.3 不同反應底物對PPO酶活性的影響

多酚氧化酶催化不同底物的反應學符合米氏方程，得到回歸方程和相關系數如圖3所示。根據直線斜率與截距，求得Km和Vmax，詳見表1。

圖3 PPO酶反應速率與不同的底物濃度的雙倒數曲線Fig.3 Double reciprocal curve of PPO reaction and substrate concentration of distinct substrates

從表1中可以看出，不同反應底物對多酚氧化酶的催化反應有不同的的Km值和Vmax值。Km值是用來表示酶對底物親和力。從Km值的物理含義可以看出，Km值愈大，則與多酚氧化酶的親和力愈小。對于同一種酶的多種反應底物時，各底物與酶的Km值則有差異。由此可知，EGC與多酚氧化酶的親和力﹥EGCG﹥焦性沒食子酸﹥EC﹥ECG，但是從反應速率來看是ECG的最大，多酚氧化酶與表兒茶素沒食子酸酯(ECG)親和力較小，這與紅茶加工過程中的多酚氧化酶酶促反應底物存在相似性［13］。因此，EGC為多酚氧化酶的最適底物。

表1 不同反應底物下的Km值和VmaxTable 1 The Kmand Vmaxabout distinct substrates of PPO

2.4 普洱茶固態發酵過程中PPO酶活性以及酶液蛋白質含量的變化規律

從圖4中可以看出，普洱茶在發酵過程中多酚氧化酶活性呈波浪式上升趨勢，在第18d和第36d，出現2個波谷，第48d出堆時活性達到最大值160U。多酚氧化酶的酶蛋白含量前期緩慢下降，中期相對穩定，第36d酶液蛋白質的含量最小為36.3mg/mL，后期有所上升，發酵末期為61.5mg/mL低于發酵初期的76.2mg/mL，因此，酶液蛋白質含量呈現緩慢的下降趨勢。

圖4 普洱茶固態發酵過程中PPO酶活性和酶液蛋白質含量的變化Fig.4 Variety of PPO activity and protein content during post－fermentation of pu－erh tea

普洱茶固態發酵過程中活性多酚氧化酶活性呈波浪式上升趨勢，在第30d和48d出現波峰。其酶活性發酵前期受發酵溫度影響，中期與發酵過程中的微生物的種類與含量有關，后期主要可能微生物生長和產生的胞外酶有關［12，14］。

2.5 普洱茶固態發酵期間PPO酶比活力的變化規律

從圖5中可以看出，多酚氧化酶的比活力有波浪式上升趨勢。在固態發酵初期，多酚氧化酶比活力有小幅度上升，第12d之后，比活力有所下降，第18d多酚氧化酶的比活力為1.41U/mg。多酚氧化酶比活力從18d到30d出現較大幅度的上升，增加幅度為111.35%，之后其比活力有所下降，在發酵末期產生了一個次波峰，多酚氧化酶的比活力為2.58U/mg。

圖5 普洱茶固態發酵期間多酚氧化酶比活力的變化Fig.5 Variety of PPO specific activity during post－fermentation of pu－erh tea

普洱茶固態發酵初期，由于酶活性的增長和酶蛋白在微生物的作用下部分降解，多酚氧化酶比活力有小幅度上升。第12d之后，由于酶活力的降幅大于蛋白質的降幅，其比活力有所下降。18d之后隨著胞外酶的出現，多酚氧化酶比活力得到進一步提高。在30d之后，由于茶葉自身酶蛋白的降解，其比活力有所下降。發酵后期隨著微生物種類趨于穩定，多酚氧化酶比活力也隨之處于較穩定的狀態。

3 結論

普洱茶固態發酵期間多酚氧化酶酶促反應的最適pH為5.5，最適溫度為55℃，最佳酶反應底物為表沒食子兒茶素(EGC)。

普洱茶固態發酵過程中多酚氧化酶酶活性呈現波浪式的上升趨勢。普洱茶固態發酵過程中酶蛋白含量在發酵前期緩慢下降，中期比較穩定，從第36d到發酵末期有所上升，總體較發酵前期有所下降，但變化比較平穩。普洱茶固態發酵過程中多酚氧化酶的比活力呈波浪式上升趨勢，在第30d和第48d時產生兩個波峰。

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