兩株紅酵母混合發酵產β-胡蘿卜素及其影響因素

彭 鵬，劉園園，劉愛民，盧存龍，高 娜，馬 雪，李瑞萍

(安徽師范大學，生命科學學院生態環境與生態安全安徽省高校重點實驗室;重要生物資源的保護和利用研究安徽省重點實驗室，安徽蕪湖241000)

類胡蘿卜素在制藥、醫學、化妝品、食品和飼料產業中具有重要價值，其中的β－胡蘿卜素不僅是維生素A的前體，具有預防眼疾、保護視力的功能，而且還具有抑制細胞變異［1］，抗癌、防癌、抗氧自由基、增強機體抵抗力，維護人體上皮組織的正常生理功能［2］，以及促進兒童生長發育、美容等一系列重要作用［3］，在世界許多國家被廣泛用作食品營養強化劑及添加劑［4］。市場上目前存在合成β－胡蘿卜素和天然β－胡蘿卜素兩種［5－6］。合成 β－胡蘿卜素有致染色體畸變作用，在西方發達國家已被限制用作食品和飼料添加劑［7］。天然β－胡蘿卜素廣泛存在于黃色和綠色蔬果中，在某些動物體內也發現含有β－胡蘿卜素，其含量有很大差異。隨著國內外對天然β－胡蘿卜素產品市場需求的增加，采用微生物發酵法生產β－胡蘿卜素有廣闊的應用前景［8－9］。國內外對于β－胡蘿卜素發酵菌株的研究主要集中在三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和紅酵母(Rhodotorula)。三孢布拉氏霉發酵產率雖然較高，但發酵技術工藝復雜、發酵周期長、成本高，不易于產業化［10－11］。紅酵母生長速率快、營養要求簡單，發酵工藝易于調控，菌體可綜合利用，且屬于我國飼料行業12種確認的飼用微生物，易于進行大規模培養、具有很高的應用價值和開發前景［10，12－13］。近年來，對紅酵母產 β－胡蘿卜素研究已有相關報道。何海燕等人［14］以甘蔗糖蜜為碳源，經搖瓶發酵初篩得到一株生物量和胡蘿卜素含量均較高的菌株 R3，發酵獲得胡蘿卜素含量0.767mg/g，胡蘿卜素產量為8.70mg/L，生物量達到11.34mg/L。梁曉華等人［15］在最適條件下搖瓶培養Rhodotorula sp.hidai Y2，類胡蘿卜素產量達到4.97mg/L。在紅酵母產β－胡蘿卜素的培養基優化、發酵條件優化及混菌發酵方面也有相關文獻。如，張志軍等人［16］研究發現蔗糖和葡萄糖作為碳源，對海洋紅酵母(Rhodotorula sp.06)的生長和色素的產生最有利，麥芽糖次之，乳糖的生物量最低。Tinoi等人［17］利用綠豆渣作為原料類胡蘿卜素產量達到了2.48mg/L。Buzzini［18］優化了一株紅酵母的培養條件，類胡蘿卜素含量達到803.2μg/g，他還應用分批補料方法，將粘紅酵母DBVPG3853與巴德利酵母DBVPG3503共同培養，玉米漿為唯一碳源，結果測得色素產量為 8.2mg/L［19］。本文在對粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)31229和一株產β－胡蘿卜素量較高的紅酵母菌株RY－01進行了初步研究的基礎上，探討其混合發酵的培養基與培養條件，并考察幾種促進劑對混合發酵中的β－胡蘿卜素產量和生物量的影響，為β－胡蘿卜素高產菌株的選育和β－胡蘿卜素的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粘紅酵母(Rhodotorula glutinis) 編號31229，購自CICC中心;紅酵母RY－01 微生物實驗室分離并保存。

UV－2000型紫外/可見分光光度計 UNICO公司;JC202型電熱恒溫干燥箱 上海成順儀器儀表公司;HYQ－150型生物搖床 武漢匯成生物科技公司;HH－1型數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子公司;TDL－40B型低速臺式大容量離心機 無錫瑞江分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基和培養方法 菌種活化培養基:麥芽汁培養基［20］;斜面培養基:采用 PDA 培養基［20］;種子培養基:采用PDA液體培養基，裝液量為100mL/250mL三角瓶;起始發酵培養基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，加水至1000mL，pH6.0，裝液量為30mL/250mL三角瓶;優化發酵培養基:麥芽糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，加水至1000mL，pH6.0，裝液量為30mL/250mL三角瓶。

種子擴培方法:從斜面上挑取兩環菌種，接入種子培養基中，混合種子液為粘紅酵母和紅酵母RY－01各挑一環接入種子培養基。30℃，180r/min，搖床培養24h。

1.2.2 菌體生物量的測定 取10mL發酵液，4000r/min離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌2次;用蒸餾水將菌體移入預先干燥至恒質量M0的稱量瓶中，置60℃電熱恒溫干燥箱中，干燥至恒質量，用精密電子天平稱量稱量瓶與菌體總質量M［21］。

細胞生物量公式為:W=1000×(M－M0)/10

式中:W－細胞生物量，g/L;M－稱量瓶與菌體的總質量，g;M0－稱量瓶的質量，g。

1.2.3 β－胡蘿卜素的提取與測定 酸熱破壁法破酵母細胞壁，參考文獻［11，22］，轉速為4000r/min。

β－胡蘿卜素的提取與測定方法，參考文獻［21］，提取溶劑為丙酮，用紫外/可見分光光度計在波長450nm下測定吸光度值。

β－胡蘿卜素質量分數計算公式為:Wc=Aλmax×D×V/0.16m

式中:Wc－發酵液β－胡蘿卜素的質量分數，μg/g干菌體;Aλmax－最大吸收波長450nm下的吸光度;D－測定試樣的稀釋倍數;V－提取色素用有機溶劑體積，mL;m－干酵母菌體質量，g;0.16－β－胡蘿卜素的摩爾消光系數，(mol× cm)－1。

β－胡蘿卜素產量(μg/L)=β－胡蘿卜素含量(μg/g)×細胞生物量(g/L)

1.2.4 實驗方法 單菌發酵與混合發酵的比較:將粘紅酵母、紅酵母RY－01和混合種子液按接種量10%分別接入起始發酵培養基，置于 30℃，180r/min，搖床培養4d后分別測定生物量和β－胡蘿卜素產量。

混合發酵培養時間實驗:將混合種子液按接種量10%接入優化發酵培養基，于30℃，180r/min，搖床培養。分別在培養 1、2、3、4、5、6d 后測定菌體生物量和β－胡蘿卜素含量。

混合發酵碳源實驗:培養基為2%碳源，1%氯化銨，0.02%磷酸氫二鉀，0.02%硫酸鎂，pH6.0，裝液量為30mL/250mL三角瓶。以葡萄糖為對照，其他碳源分別為乳糖、半乳糖、淀粉、麥芽糖、甘露醇、甜醇、木糖和吐溫－80。將混合種子液按接種量10%接入培養基，于30℃，180r/min，搖床培養4d后分別測定生物量和β－胡蘿卜素產量。

混合發酵氮源實驗:培養基為2%麥芽糖，1%氮源，0.02%磷酸氫二鉀，0.02%硫酸鎂，pH6.0，裝液量為30mL/250mL三角瓶。以氯化銨為對照，其他氮源分別為蛋白胨、硝酸鉀、尿素和硝酸銨。將混合種子液按接種量10%接入培養基，于30℃，180r/min，搖床培養4d后分別測定生物量和β－胡蘿卜素產量。

混合發酵無機鹽實驗:以優化發酵培養基為對照，在優化發酵培養基中分別添加硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸銨。設置的濃度梯度為 0.3%、0.5%、0.7%、1.0%，調整pH6.0。將混合種子液按接種量10%接入培養基，于30℃，180r/min，搖床培養4d后分別測定生物量和β－胡蘿卜素產量。

混合發酵中促進劑的影響:在優化發酵培養基中分別添加檸檬酸三鈉和橘子皮干粉浸汁，調整pH6.0。檸檬酸三鈉濃度梯度設置為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%;取橘子皮干粉 10g，加水 50mL，50℃水浴1h后四層紗布過濾，定容至50mL，分別按體積比2%、4%、6%、8%、10%加入優化發酵培養基中。將混合種子液按接種量10%接入培養基，于30℃，180r/min，搖床培養4d后分別測定生物量和β－胡蘿卜素產量。

2 結果與分析

2.1 兩株紅酵母的形態

由圖1可知，紅酵母菌株RY－01和粘紅酵母31229不論在菌落形態和顯微形態上，兩者差異都很明顯，紅酵母菌株RY－01菌落較大，色深，菌體呈近圓形;粘紅酵母31229菌落較小，色較淺，菌體呈橢圓狀。

圖1 兩株紅酵母在PDA培養基上的菌落形態(a)和顯微形態(10x40)(b)Fig.1 The colony in PDA culture medium(a)and micrograph morphology(10x40)(b)of two Rhodotorula Strains

2.2 單菌發酵與混合發酵結果

由圖2可知，在30℃，180r/min，搖床培養4d后，紅酵母RY－－01和混合菌的菌體生物量均高于粘紅酵母，分別為24.19g/L和23.56g/L;與單菌發酵相比，混合發酵所得到的β－胡蘿卜素產量顯著提高，達到 8837.83μg/L。高于 Buzzini利用粘紅酵母DBVPG3853與巴德利酵母DBVPG3503混菌發酵所得的類胡蘿卜素產量 8.2mg/L［18］。

圖2 不同菌種發酵的菌體生物量和β－胡蘿卜素產量Fig.2 Biomass and β－carotene production from different strains

2.3 培養時間對混合發酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響

由圖3可知，培養時間對混合發酵的菌體生物量和β－胡蘿卜素含量有很大影響。在30℃，搖床轉速為180r/min的條件下培養1d時，用分光光度計檢測不到β－胡蘿卜素，菌體生物量在第3d時達到最大值，為15.52g/L;菌體中β－胡蘿卜素產量則在培養4d時達到最高值，為2081.25μg/L。而到培養5d時，菌體生物量和β－胡蘿卜素產量均急劇下降。因β－胡蘿卜素是紅酵母的次生代謝產物，其含量的積累與菌體生物量的積累并不同步，在時間上有一定的滯后性，主要在菌體生長穩定期產生。

圖3 培養時間對生物量和β－胡蘿卜素產量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on biomass and β－carotene production

2.4 碳源對混合發酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響

從圖4可以看出，兩株紅酵母混合發酵的最適碳源為麥芽糖。在30℃，180r/min，搖床培養4d后，以麥芽糖為碳源的培養基中生物量和β－胡蘿卜素產量均最高，分別為8.62g/L和1437.50μg/L。在本實驗中，為了排除天然物的影響，未使用最佳氮源，同時缺少酵母需要的生長因子，采用合成培養基，故而生物量和β－胡蘿卜素產量明顯偏低。

圖4 碳源對菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響Table 4 Effect of carbon source on biomass and β－carotene production

2.5 氮源對混合發酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響

由圖5可以明顯看出，蛋白胨是兩株紅酵母混合發酵的最適氮源。在30℃，180r/min，搖床培養4d后，在蛋白胨為氮源的培養基中生物量和β－胡蘿卜素產量顯著高于其他氮源培養基，達到23.80g/L和5225.0μg/L。而在尿素為氮源的培養基中生物量和β－胡蘿卜素產量最低，為4.58g/L和37.50μg/L。

2.6 無機鹽對混合發酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響

圖5 氮源對菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on biomass and β－carotene production

從圖6－a和圖6－b可知，總體而言，無機鹽的使用對混合發酵中菌體生物量和β－胡蘿卜素產量有一定的影響作用。隨著K+濃度的上升，菌體生物量和β－胡蘿卜素產量呈現下降的趨勢，當硫酸鉀為0.3%時最高，為12.07g/L和2703.13μg/L，略高于對照組;隨著Mg2+濃度的上升，菌體生物量先增后減，在硫酸鎂濃度0.7%時最高，為12.15g/L，而β－胡蘿卜素產量在硫酸鎂濃度1.0%時達到2734.38μg/L，略高于對照組;NH+4濃度的增加對菌體生物量和β－胡蘿卜素產量均有一定的促進作用，但低于對照組。

圖6 無機鹽對菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響Fig.6 Effect of inorganic salt on biomass and β－carotene production

2.7 促進劑對混合發酵菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響

由圖7可知，在30℃，180r/min，搖床培養4d后，檸檬酸三鈉濃度為0.4%時菌體生物量達到16.57g/L，隨著濃度的升高，菌體生物量的略有遞減，趨勢不大;與菌體生物量相反，檸檬酸濃度為1.2%時β－胡蘿卜素產量達到最大值2643.75μg/L，并且隨著濃度的增加，呈現出先增加后減少的趨勢。表明檸檬酸濃度為1.2%時對菌體產β－胡蘿卜素的量有一定促進作用。由圖8可知，橘子皮干粉浸汁為6%時菌體生物量和β－胡蘿卜素產量均達到最高，分別為16.57g/L和3868.75μg/L，并且隨著浸汁使用量的增加呈現先增后減的趨勢。β－胡蘿卜素是紅酵母生長過程中的次生代謝產物，一些前體物質的使用對紅酵母產β－胡蘿卜素有一定的促進作用。實驗中，對照組的菌體生物量和β－胡蘿卜素產量為11.73g/L和2531.25μg/L，檸檬酸三鈉和橘皮干粉浸汁對菌體生物量有較強的促進作用，橘皮浸汁對β－胡蘿卜素產量的促進作用比檸檬酸三鈉效果更明顯。

圖7 檸檬酸三鈉對菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響Fig.7 Effect of trisodium citrate on biomass and β－carotene production

圖8 橘皮粉浸汁對菌體生物量和β－胡蘿卜素產量的影響Fig.8 Effect of orange peel powder extract on biomass and β－carotene production

3 結論

3.1 粘紅酵母和紅酵母RY－01混合發酵，在30℃，180r/min，搖床培養4d后，菌體生物量和β－胡蘿卜素產量達到23.56g/L和8.8mg/L。比Buzzini利用粘紅酵母DBVPG3853與巴德利酵母DBVPG3503混菌發酵所得的類胡蘿卜素產量8.2mg/L要高。

3.2 碳源、氮源的選擇對混合發酵的菌體生物量和β－胡蘿卜素產量有很大影響，實驗結果表明，粘紅酵母和紅酵母RY－01混合發酵的最適碳源是麥芽糖，最適氮源為蛋白胨;K+和Mg2+的使用對混合發酵有一定的促進作用，但效果不顯著。與對照組相比，硫酸鉀濃度為0.3%時，菌體生物量和β－胡蘿卜素產量分別提高了2.8%和6.8%;當硫酸鎂濃度0.7%時，菌體生物量提高了3.6%，當濃度為1.0%時β－胡蘿卜素產量提高了8.0%。

3.3 β－胡蘿卜素是紅酵母生長過程中的次生代謝產物，其含量的積累與生物量的積累并不同步，在時間上有一定的滯后性。培養基中添加適量的代謝前體物質，有利于β－胡蘿卜素的積累。本實驗中，添加6%的橘皮干粉浸汁后，混合發酵的菌體生物量和β－胡蘿卜素的比對照組分別提高了41.3%和52.8%。

本實驗采用了兩種不同紅酵母混合發酵，探討其混合發酵的培養基與培養條件，并考察了檸檬酸三鈉和橘皮干粉浸汁兩種促進劑對混合發酵中的β－胡蘿卜素產量和生物量的影響，為β－胡蘿卜素高產菌株的選育和β－胡蘿卜素的進一步開發利用提供參考。

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