響應面優化酶解馬骨粉工藝的研究

秦娜娜，侯偉偉，張雙雙，李天蘭，李 可，楊海燕

(新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052)

目前，中國有馬近 892×104匹，居世界第一［1］。新疆有馬102.5×104匹，與內蒙古(108.4×104匹)相近，居全國第二［2］。生馬骨中蛋白質和脂肪含量分別為12.8%和8.5%，骨中含有構成蛋白質的所有氨基酸，且比例均衡、必需氨基酸水平高，屬于優質蛋白［3－4］。人們通過對酶解機理、酶解原料、酶及酶解液等方面進行了大量的深入研究［5］，發現酶法水解優點體現在溫和，易控、有定向、反應時間短，無環境污染，產品營養價值高等。利用可控酶解技術水解骨蛋白，作為保健品的重要基料，具有良好的加工特性、營養功能和生理活性，符合當前消費者對畜禽產品“天然、營養、安全、健康”的消費趨勢［6－8］。在國內對骨的利用還停留在落后階段，只是將骨熬湯，制成骨膠等食品添加劑［9］。近些年隨著消費觀念的轉變，“以骨補骨”的意識不斷增強，骨食品在研發方面取得了明顯的成績。在國外骨食品的開發已經很普遍，采用超微粉碎技術生產食用骨粉、骨糊、骨膠、骨漿、骨肉蛋白粉及骨提取物等各種骨產品及高質量蛋白質。本實驗以氮收率和水解度為指標，在單因素基礎上，采用二次旋轉組合設計實驗優化最佳酶解工藝條件［10］。針對熏馬肉、熏馬腸中剩余副產物馬骨進行綜合利用，形成具有較高副加值產品，這樣不僅可以減少骨資源的浪費，獲得更大的經濟效益，更重要的是通過加工工藝的改進，豐富了消費者食材。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生馬骨 新疆霍城縣馬產業基地;胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶 南寧龐博生物技術有限公司;正己烷、濃硫酸、氫氧化鈉 天津市福晨化學試劑廠;硫酸銅、硫酸鉀 天津市化學試劑三廠;甲基紅指示劑(C15H15N3O2)、溴甲酚綠指示劑(C21H14Br4O5S)等 均為分析純。

AL204－1C電子分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司;HH－2型數顯恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司;凱氏定氮裝置 四川(崇州)蜀玻有限公司;TDL－5離心機 上海安亭科學儀器廠;pH計 德國Sartorius公司;PL3000真空冷凍干燥儀 Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水解度的測定方法 鄰苯二甲醛滴定法［11］。水解度(%)=水解液中的總游離氨基酸態氮含量/原料中的總氮量×100

1.2.2 氮收率的測定方法［12］根據公式計算氮收率:氮收率(%)=水解液中蛋白含量/原料中蛋白質含量×100

1.2.3 工藝流程

1.2.4 酶種類的篩選 根據酶切位點的不同，分別采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶在其各自的最適溫度、pH條件下，料液比 1∶6g/mL、加酶量 6000U/g、酶解時間 4h，對馬骨蛋白進行水解，以水解度、氮收率來確定最佳用酶。

1.2.5 單因素實驗 確定酶解溫度、料液比、pH、加酶量、時間五個因素，對氮收率和水解度的影響。

1.2.6 響應面法優化酶解工藝 在單因素實驗的基礎上，運用Box－Behnken的中心組合設計原理，在酶解時間已經確定的基礎上，以水解度為響應值，選擇酶解溫度、料液比、pH、加酶量，進行四因素三水平響應面優化實驗［10］。見表 1。

表1 實驗因素水平表Table 1 The factor and level of test

2 結果與分析

2.1 酶種類的篩選結果

由圖1可知，馬骨粉未加酶的水解度和氮收率較低，添加酶后都有增加，其中堿性蛋白酶水解度、氮收率均最高，分別為:14.41%、68.25%，因此選擇堿性蛋白酶為水解用酶。5種不同蛋白酶對馬骨粉水解的影響順序為:堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。

圖1 酶種類的篩選Fig.1 Select about the types of the enzyme

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 溫度對酶解的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的增加水解度和氮收率都增加，50℃時數值最大，大于50℃其數值有顯著下降趨勢。因為，低于酶的最適溫度，酶的活性比較小，高于酶的最適溫度會導致酶部分或全部失活，酶活力會迅速下降［13］。

圖2 溫度對酶解的影響Fig.2 The influence of temperature on enzymatic hydrolysis

2.2.2 料液比對酶解的影響 由圖3可知，馬骨粉酶解液的水解度和氮收率都是伴隨著料液比的不斷降低呈上升的趨勢，這主要是因為料液比越大，酶和底物接觸不充分，造成樣品中堿性蛋白質酶解不完全。料液比越小，堿性蛋白酶和底物接觸的位點越充分，但是如果馬骨粉酶解液中可溶性的固形物含量太低，則不利于酶解液的冷凍干燥。因此，結合實際情況，選擇適宜的料液比為1∶6g/mL。

圖3 料液比對酶解的影響Fig.3 The influence of solid－liquid ratio on enzymatic hydrolysis

2.2.3 pH對酶解的影響 pH是影響酶活力的重要因素之一，因為酶要發揮其催化功能，活性基團部位必須有一定的解離形式。pH會影響酶分子的構象和酶分子及底物的解離狀態，從而影響酶活性和酶促反應速度，pH過高或過低都不利于酶解反應。由圖4可知，pH為9時馬骨粉的水解度和氮收率最高。低于最適pH酶活力比較小，高于最適pH酶部分失活或全部失活，導致水解度和氮收率均下降［14］。

圖4 pH對酶解的影響Fig.4 The influence of pH on enzymatic hydrolysis

2.2.4 加酶量對酶解的影響 由圖5可知，隨著加酶量的增加，馬骨粉的氮收率和水解度在增加，低于6000U/g水解度和氮收率增加較快，高于6000U/g增加緩慢。隨著加酶量的增加，酶與底物不斷增加位點接觸，加酶量在6000U/g時，酶與底物的接觸位點已經比較充分，再增加酶用量其水解度和氮收率變化不大，因此選擇最適的加酶量為6000U/g。

圖5 加酶量對酶解的影響Fig.5 The influence enzymatic hydrolysis of enzyme

2.2.5 時間對酶解的影響 由圖6可知，隨著酶解時間的延長，水解度和氮收率顯著增加，4h時達最大值，大于4h趨于穩定。因為酶解時間過短，蛋白水解不完全，隨時間的延長，蛋白充分酶解，當酶解達到最大，增加酶解時間不會增加水解程度。因此，選擇酶解時間為4h最佳。

圖6 時間對酶解的影響Fig.6 The influence of time on enzymatic hydrolysis

2.2.6 響應面實驗設計結果 運用Design Expert8.0Trial設計，展開29組實驗，結果見表2。

根據表3所得的實驗數據，運用Design Expert8.0 Trial統計軟件進行處理，采用響應曲面統計方法對實驗數據進行擬合，建立酶解溫度、料液比、酶解pH與加酶量四因子的二次多項數學回歸方程:

Y=18.40－2.63X1+0.53X2－0.092X3+0.7X4+0.55X1X2－0.42X1X3+0.15X1X4+0.72X2X3－1.62X2X4+0.13X3X4－2.26X12－1.72X22－2.31X32－1.75X42

進一步對該回歸模型的顯著性進行檢驗，響應曲面的數據方差分析結果見表3，分析結果顯示模型的 F=59.36＞F0.05(14，14)=2.48，p＜0.0001，表明回歸模型極顯著。失擬項 F=1.92＜F0.05(14，10)=2.60，p=0.2776＞0.05，不顯著，說明該模型擬合程度良好，實驗誤差小。因此，可以選擇用此模型來分析和預測酶解法制取馬骨營養多肽粉的工藝結果。同時一次項 X1、X2、X4極顯著，交叉項 X2X3、X2X4極顯著、X1X2顯著，平方項值都是極顯著性影響。最佳實驗結果:酶解溫度47.1℃，料液比1∶6.98g/mL，酶解pH9.02，加酶量6180U/g。結合實際操作條件，酶解溫度 47℃，料液比1∶7g/mL，酶解 pH9，加酶量6200U/g，此時最大的水解度為17.8%。

表2 Box－Behnken實驗設計及結果Table 2 The design and results of Box－Behnken

通過3組平行實驗，檢驗模型預測的準確性。所得酶解最大水解度平均值為17.47%(誤差值小于0.05%)。建立的模型比較符合實際情況，響應面法優化酶解馬骨粉工藝參數可行。

2.2.7 響應曲面模型結果分析 通過對模型的響應面以及相對應的等高線圖進行分析，得出各因素的交互作用對酶解的影響和預測最優值，并對模型的預測最優值進行驗證，從而確定預處理工藝酶解的最佳條件。模型的響應曲面及其等高線見圖7～圖9。

響應曲面出現最高點，在等高線面具有橢圓形中心區域，說明因素在所選擇范圍內能產生最佳的響應值，因素的選擇在實驗范圍內合理并且有效，能夠反映出響應值的影響趨勢。響應曲面坡度較大，未出現最高點;在等高線面上具有部分橢圓形中心區域，表明具有交互作用，但無最佳響應值。極值條件應在等高線的橢圓圓心處。由圖7～圖9和表3可知，酶解溫度與料液比對馬骨脫脂中總蛋白質含量的交互作用顯著，料液比與pH、料液比與加酶量的交互作用極顯著。

表3 回歸模型方差分析及模型系數顯著性檢驗Table 3 The Variance analysis and coefficients significant inspection of the model

圖7 Y=f(X1，X2)響應曲面立體圖及等高線Fig.7 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X1，X2)

圖8 Y=f(X2，X3)響應曲面立體圖及等高線Fig.8 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X2，X3)

3 結論

圖9 Y=f(X2，X4)響應曲面立體圖及等高線Fig.9 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X2，X4)

本實驗以脫脂馬骨粉為原料，以水解度和氮收率為響應值，對5種蛋白酶進行比較，選擇堿性蛋白酶為水解用酶。在單因素的基礎上，通過二次旋轉組合設計優化最佳酶解工藝參數為:酶解溫度47℃，料液比 1∶7g/mL，酶解 pH9，加酶量 6200U/g，酶解時間4h，在該條件下水解度為17.47%。通過本實驗實驗可以看出，酶解法可以顯著提高馬骨粉水解度和增加馬骨粉綜合利用。

［1］劉云.發展馬肉加工業大有可為［J］.食品工業，2004(6):31－32.

［2］甘肅農業大學主編.養馬學［M］.北京:中國農業出版社，1981.

［3］ZARKADAS C G，YU Z，ZARKADAS G C，et al.Assessment of the protein quality of bone isolates for use an ingredient in ment and poultry products［J］.J Agri Food Chem，1995，43(1):77－83.

［4］Field R A，Chang Y O，Kruggel W G.Protein quality of mechanically processed product and bone residue［J］.J Food Sci，1999，44(3):690－695.

［5］Ney K H.Hydrolysis of deliberated proteins［J］.Journal of Food Science，2002，24(3):87－89.

［6］王民樂.食品行業的經濟背景、態勢與發展趨勢［J］.食品科學，2000(12):161－164.

［7］夏秀芳.畜禽骨的綜合開發利用［J］.肉類加工，2007(5):22－25.

［8］孫衛青，馬麗珍，王芳.骨食品開發研究前景廣闊［J］.肉類工業，2001(1):43－44.

［9］徐俊華，王慧明.牛肌腱膠原蛋白的提取及多孔支架的制作［J］.中國口腔種植學雜志，2005(9):35－36.

［10］張曉娜，周素梅，王世平.二次回歸正交旋轉組合設計對麥麩中阿拉伯木聚糖酶解工藝的優化［J］.食品科學，2008，29(1):141－145.

［11］寧正祥.食品成分分析手冊［M］.北京:中國輕工業出版社，1998，119－124.

［12］翟永信.現代食品分析手冊［M］.北京:北京大學出版社，1988，176－239，277，342－356.

［13］楊銘鐸.豬骨呈味物質提取的研究［I］:酶解豬骨最佳工藝條件［J］.食品科學，2007，28(9):210－215.

［14］賈冬英，趙宏銘，姚開，等.鰱魚頭及骨中蛋白質的酶解條件優化［J］.食品科技，2007(4):243－246.