一株墨魚干源中度嗜鹽菌的系統發育分析與生長特性

許愛清，周士鐳，馮杏杏，羅玉金，吳禹恒

(湖南科技大學生命科學學院，湖南湘潭411201)

墨魚(烏賊，Sepia officinalis)是一種名貴的海產品，市場中主要有兩種產品形式:冰凍墨魚鮮品和鹽漬風干后的墨魚干制品。出于保鮮和安全的考慮，人們對冰凍墨魚的微生物檢測關注度較高，研究人員從意大利生產和馬來西亞進口冷凍墨魚中分離到嗜鹽性的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)［1－2］，認為冰凍墨魚是這種能引起消費者發生急性腸胃炎致病菌的重要載體;研究也發現依賴NaCl生長的假單胞菌(Pseudomonas)是葡萄牙產冰凍保鮮墨魚的主要腐敗菌［3］。墨魚干是新鮮墨魚經過鹽漬蒸熟、晾曬風干后制成的墨魚制品，在市售墨魚干表面常見有鹽漬菌斑，但是對干制墨魚產品的微生物檢測鮮見報道。本研究對菌斑中的耐(嗜)鹽細菌進行了分離純化，并對一株嗜鹽菌進行了系統發育分析，檢測了其部分生物學特性。研究結果能為了解墨魚干表面菌斑中微生物種類與特性，以及對其生長的控制提供參考，有助于提高墨魚干產品的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

墨魚干，表面有明顯的白霜狀鹽漬菌斑 市售;含5%NaCl培養基:0.5%蛋白胨，0.5%牛肉膏，5%NaCl，自來水配制，pH 自然，121℃ 滅菌25min。制備固體培養基時需添加2%的瓊脂粉;含TaKaRa Taq(5U/μL)和10 × PCR 緩沖液(含 MgCl2，15mmol/L)的TaKaRa TaqTMDNA多聚酶試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司;dNTPs(各 2.5mmol/L)、16S rDNA PCR通用引物:27F(5′－AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG－3′)、1492R(5′－GGY TAC CTT GTT ACG ACT T－3′) 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;其它試劑均為進口或國產分析純。

MycyclerTMThermal Cycler PCR 儀、PowerPacTMBasic電泳儀 美國Bio－Rad公司;Kodak Gel Logic 212凝膠成像系統 Carestream Health INC.USA;752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;CT15RT通用冷凍離心機 上海天美(Techcomp)公司;SP500自動高壓蒸汽滅菌器 日本Yamato公司;SPX－250BS－II生化培養箱 上海新苗醫療器械制造公司;江南YS100生物顯微鏡 南京江南永新光學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜鹽菌的分離純化 取一片完整的墨魚干，刮取其帶白霜部位表面碎屑少許，懸浮于含5%NaCl液體培養基，25℃，150r/min振蕩培養24h富集耐鹽細菌。制成的菌懸液經適度稀釋，涂布于含5%NaCl培養基固體平板，25℃培養48h，挑取單菌落，繼續劃線分離純化后，轉接到含5%NaCl培養基斜面，4℃保存。

1.2.2 菌株的形態學觀測 移取5%NaCl液體培養基中菌體制成涂片，經石碳酸復紅單染色，普通光學顯微鏡油鏡下觀測菌體形態。

1.2.3 耐鹽度測定 液體菌種是將斜面上菌苔轉接到含5%NaCl液體培養基，25℃、150r/min振蕩培養24h的菌懸液。菌種稀釋液組成為用0.5%蛋白胨和0.5%牛肉膏的去離子水溶液。將液體菌種稀釋100倍以降低菌種液的鹽度，再按1%量接種于NaCl濃度為 0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%和32%的液體培養基，25℃、150r/min振蕩培養24～48h，觀察比較菌懸液的渾濁度，評判菌的生長狀態。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析 將受試菌株培養于含5%NaCl液體培養基后，離心收集菌體細胞，通過SDS堿裂解法抽提細菌基因組DNA［4］，以1.0%瓊脂糖電泳檢驗 DNA純度，－20℃保存備用。用16S rDNA通用引物27F和1492R進行PCR擴增菌株16S rRNA基因。PCR反應體系:10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5.0μL、dNTPs(各 2.5mmol)1.0μL、引物27F(20μmol/L)和 1492R(20μmol/L)各 1.0μL、TaKaRa Taq(5U/μL)0.25μL、DNA 模板 1.0μL，補加滅菌蒸餾水至50μL。PCR擴增反應條件:95℃預變性 4min;然后 95℃ 變性 50s，52℃ 退火 1min，72℃延伸2min，共30個循環;最后72℃延伸10min。PCR產物經1.0%瓊脂糖電泳檢測，純化后送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序。雙向測定的16S rDNA序列合并后，通過 blastN(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)程序在GenBank中搜索比對相似序列，以 E值(Expectation values)＜1.0e－05為標準判別同源比對具有顯著性意義，指示兩者為同源序列。并通過 BankIt軟件提交序列到GenBank中。

參照 LPSN(ListofProkaryoticnameswith Standing in Nomenclature)數據庫中鹽單胞菌屬(Halomonas)和棲鹽田菌屬(Salinicola)的菌種名和模式菌株在GenBank/EMBL/DDBJ數據庫中的登錄號(http://www.bacterio.cict.fr/h/halomonas.html)，從GenBank的nucleotide數據庫中搜索選擇一些模式菌株的16S rDNA序列。所選擇的鹽單胞菌屬的模式菌株至少具有特征之一:分離自中國的鹽湖海水等環境中;分離來自韓國等傳統發酵海產食品基質;是耐鹽菌，在0%～20%NaCl鹽度下能生長。首先，將模式菌株與待測菌株的16S rDNA序列用ClustalW 1.83程序進行多序列比對;然后，利用分子進化遺傳分析軟件MEGA5.10構建N－J系統發生樹(Neighbor－Joining tree)，基本參數:系統發育樹可靠性檢驗的自舉值(Bootstrap Value)設定為1000次;替代模型(Substitution Model)選擇 Kimura 2－parameter model。以棕櫚發酵細菌(Zymobacter palmae)的模式菌株作外群［5］，分析待測菌株的系統發育地位。

1.2.5 溫度對菌株生長的影響 將新鮮菌液按1%接種量接種于含5%NaCl培養基中，置于5、10、15、25、37、42、45、50℃等溫度下，150r/min 振蕩培養24～72h，觀測比較培養液濁度。

1.2.6 硝酸鹽濃度的影響及硝酸鹽還原作用檢測含NaNO3培養基:0.5%蛋白胨，0.5%牛肉膏，按需要添加調整NaNO3的質量百分比濃度，自來水配制，pH自然，121℃滅菌25min。

取5%NaCl液體培養基中新鮮菌種懸液，按1%接種量接種含NaNO3濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%的液體培養基，25℃，150r/min培養24～72h，測定菌株對硝酸鹽濃度的耐受性。

為檢測菌株生長過程中能否產生亞硝酸鹽，每12h移取含2%NaNO3培養液中菌懸液，經10000×g離心去除菌體，向2mL上清液中依次加入100μL 0.4%對氨基苯磺酸溶液和100μL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，溶液變為(粉)紅色則判定菌株能將硝酸鹽轉化成亞硝酸鹽(NaNO2)，即具有硝酸鹽還原作用為陽性;若該反應為陰性，則往上清液中加少量鋅粉將硝酸根還原成亞硝酸根后，再根據顏色反應來確認反應結果［6］。

1.2.7 食品防腐劑的影響 參照在水產或肉制品中容許使用的防腐劑及其最大使用量［7］，選用食品級規格的山梨酸鉀(最大容許劑量為0.1%)、苯甲酸鈉(0.1%)、脫氫乙酸鈉(0.05%)、雙乙酸鈉(0.1%)、焦亞硫酸鈉(0.01%)和乳酸鏈球菌素(Nisin，0.05%)。在含5%NaCl培養基中分別添加各種防腐抑菌劑至最大容許劑量和對倍稀釋劑量，取5%NaCl培養液中菌種按1%量接種后，25℃，150r/min培養24～72h，觀測比較培養液濁度，檢測各種防腐劑的最小抑制濃度。

2 結果與討論

2.1 結果分析

2.1.1 菌株的形態 墨魚干表面碎屑在5%NaCl液體培養基中富集培養24h，生長出較濃濁的菌懸液。經涂布平板和單菌落劃線分離，得到一個耐鹽菌株NYJ01。它在5%NaCl固體培養基上，28℃、48h生長的菌落形態和顯微鏡(油鏡)下的菌體形態見圖1。菌落呈乳白色、隆起、邊緣整齊、菌落直徑 0.5～1.5mm。菌體細胞為球狀或短桿狀，單個排列。

圖1 菌株NYJ01的菌落和細胞形態Fig.1 Morphology of colony and cells of the strain NYJ01

2.1.2 16S rRNA基因序列分析 對菌株NYJ01的16S rDNA進行PCR擴增，PCR產物測序得到1462nt核苷酸序列，在 GenBank中提交的登錄號是KC854246。將序列在GenBank數據庫進行BLAST搜索比對，結果表明它與鹽單胞菌屬和棲鹽田菌屬中一些菌株的16S rDNA序列的一致性高達99%。選擇這兩個屬中模式菌株與菌株NYJ01的16S rDNA序列構建出的系統發育樹如圖2所示。系統發育分析顯示菌株NYJ01與棲鹽田菌屬細菌聚類為一個分枝，尤其是與該屬的模式菌株關聯棲鹽田菌(Salinicola socius)之間的親緣關系最近。因此，可以確定菌株NYJ01是一種棲鹽田菌，暫定為Salinicola sp.NYJ01。

2.1.3 菌株的部分生理特性 菌株Salinicola sp.NYJ01的耐鹽性測定結果顯示:在同樣接種量的情況下，在僅含NaCl為無機鹽的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，1%～20%NaCl范圍內都能生長，最適范圍是3%～10%NaCl，其菌懸液最渾濁，可見大量的細胞凝聚團塊。菌株的耐鹽性表明菌株NYJ01是一種中度嗜鹽菌。

菌株NYJ01的生長溫度范圍是10～45℃，其最適范圍是25～37℃。在25℃以下，菌體生長緩慢，尤其是在10℃左右時，經72h振蕩培養后培養液濁度無明顯變化。結果表明菌株NYJ01是一種中溫菌，可以利用10℃以下低溫抑制其生長繁殖。

表1 菌株NYJ01與鹽田菌屬細菌的部分表型特性對照Table 1 Differential phenotypic characteristics of the strain NYJ01 and the close related Salinicola species

圖2 基于16S rRNA基因構建的N－J系統發育一致樹Fig.2 Neighbor－joining phylogenetic consensus tree based on the 16S rRNA gene sequences

菌株NYJ01能在僅含0.5%～15%NaNO3為無機鹽的牛肉膏蛋白胨培養液中生長。含NaNO3培養液離心后，上清液中加入亞硝酸鹽測定試劑，溶液不變紅色，表明它不能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，即硝酸鹽還原作用陰性。可以推斷菌株在高鹽食品基質上生長，不會引起亞硝酸鹽危害。

菌株NYJ01與鹽田菌屬細菌的部分表型特性列舉見表1。對照結果表明菌株NYJ01與同屬的4個模式菌株在生理特性上不完全相同，可能是一種新種或者是變種。

2.1.4 食品防腐劑對菌株生長的影響 選用6種食品級規格的防腐劑，以食品添加劑使用標準［7］中最大容許使用量為上限，經對倍稀釋處理后，添加到5%NaCl牛肉膏蛋白胨液體培養基中，接種NYJ01，25℃培養72h的后，菌體細胞的生長情況見表2。

表2 食品防腐劑對菌株NYJ01生長的影響Table 2 Effect of some food preservatives on the growth of strain NYJ01

表2數據表明:在食品中添加的最大容許劑量下，焦亞硫酸鈉(0.01%)和乳酸鏈球菌素(Nisin，0.05%)不能抑制菌株NYJ01生長;而其它幾種食品防腐劑在最大容許劑量下都能抑制菌株NYJ01生長，并且在對倍稀釋后都有不同程度的抑制作用。可利用0.025%雙乙酸鈉、0.05%山梨酸鉀、0.05%苯甲酸鈉或0.05%脫氫乙酸鈉分別抑制菌株NYJ01生長。

2.2 討論

2.2.1 耐鹽菌NYJ01的分類地位 本次分離所得菌株NYJ01的16S rDNA序列與鹽單胞菌屬和棲鹽田菌屬的一些菌株一致性達到99%。鹽單胞菌屬廣泛分布于含鹽環境，如海水、鹽湖、鹽田或人工鹽水。在伯杰氏手冊中僅描述了23種［8］。近年來，陸續發現鹽單胞菌屬中的很多新種，最新發布的鹽單胞菌屬中已有 83個有效菌種名(http://www.bacterio.cict.fr/h/halomonas.html)。就細胞形態和分離基質來說，僅有鹽脫氮鹽單胞菌(H.halodenitrificans)為球狀或短桿狀，最初分離自腌肉的鹽水中;食物鹽單胞菌(H.alimentaria)是球狀或短桿狀，分離自韓國傳統發酵海產品(jeotgal，飛翅魚)［9］。除菌體形態相似，在細菌耐鹽性和生長溫度范圍方面，菌株NYJ01與上述分離自食品基質的中度嗜鹽菌有明顯的不同。系統發育分析結果表明，在國內分離所得的十多種鹽單胞菌屬細菌在系統發育樹上分布比較離散，菌株NYJ01與該屬的鹽漬鹽單胞菌(H.salaria)具有最近的親緣關系，但該種已經轉變為棲鹽田菌屬新種［10］。

棲鹽田菌屬是一個2007年建立的新屬［11］。屬的模式種是關聯棲鹽田菌，其它有效種包括鹽棲鹽田菌和嗜鹽棲鹽田菌(S.halophilus)［10］，以及中國學者(2013年)從養雞場土壤中分離鑒定的新種——澤澍棲鹽田菌(S.zeshunii)［12］。系統發育分析結果表明，菌株NYJ01與該屬的所有模式菌株聚類為一個分枝，而且與模式種關聯棲鹽田菌之間的親緣關系最近。菌株NYJ01是棲鹽田菌屬的成員之一，但由于在部分生理特性方面，它又與4種棲鹽田菌之間不完全相同。因此，菌株NYJ01是否是棲鹽田菌屬的一個新種或變種，需要做詳盡的生理生化實驗才能予以確定。

2.2.2 耐鹽菌NYJ01在墨魚干上的功能 墨魚(烏賊)作為一種營養和藥用價值較高的海產品，生產加工的墨魚干產品會不可避免地攜帶海生的耐鹽微生物，因此，在墨魚干產品表面經常可見到鹽漬白斑。本次鑒定的嗜鹽菌菌株NYJ01，分離自墨魚干帶菌斑的表面，表明該菌與菌斑的形成存在一定關聯。菌株NYJ01生長的營養要求簡單，適應性強，耐鹽范圍和溫度范圍都比較廣泛，只要提供適宜溫度和鹽度，就能大量生長繁殖。一方面，如果認為該菌是墨魚干產品的污染菌而有必要控制其生長繁殖，本研究提供了一些基礎數據，即可以使用食品防腐劑，例如0.025%雙乙酸鈉、0.05%山梨酸鉀、0.05%苯甲酸鈉或0.05%脫氫乙酸鈉分別抑制菌株NYJ01生長。還可以采用10℃以下的低溫控制這種細菌的生長繁殖。

另一方面，可以認為墨魚干產品表面生長耐鹽菌是一種自然發酵過程。迄今未見到因食用有嗜鹽菌生長(或污染)的墨魚干而引起食品安全問題的報道。本實驗表明菌株NYJ01屬于硝酸鹽還原陰性細菌，它不會引起食品中亞硝酸鹽危害的問題，可以認為菌株NYJ01是一種食用安全風險較低的細菌。嗜鹽菌的生長過程中能產生大量蛋白酶和核酸酶，它們分解蛋白質產生谷氨酸，以及促使核酸分解產生核苷酸，這可能與日常飲食中用墨魚干熬制的湯汁非常鮮美有關。此外，資料表明能適應生存于相當廣泛鹽度范圍的嗜鹽菌，其對高鹽度的適應機制之一是“胞內有機溶質策略”，即在細胞內合成或積累大量的相容性溶質分子，例如四氫嘧啶(ectione)和甜菜堿(glycine betaine)等，并將鹽排出細胞質［13］。嗜鹽菌產生的四氫嘧啶等相容性物質對蛋白質和細胞結構具有保護作用，它們是一類有待開發的極具潛力的功能食品添加劑［14］。就這方面來說，菌株NYJ01存在于墨魚干產品中則具有積極的意義。

3 結論

本實驗從市售墨魚干表面分離純化出一株嗜鹽菌NYJ01。通過16S rDNA測序和系統發育分析表明它是一種鹽田菌屬細菌(Salinicola sp.)。這種中度嗜鹽菌能在1%～20%NaCl濃度下生長，最適濃度是3%～10%NaCl;生長溫度范圍是10～45℃，最適溫度是25～37℃，可以利用10℃以下低溫抑制其生長繁殖;它不具有硝酸鹽還原作用，不會引起墨魚干制品產生亞硝酸鹽危害;可利用0.025%雙乙酸鈉、0.05%山梨酸鉀、0.05%苯甲酸鈉或0.05%脫氫乙酸鈉分別抑制菌株NYJ01生長。

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