食用精煉大豆油DNA提取及單管巢式PCR檢測(cè)

姚 芹，宋 浩，陳 楓

(1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇省食品安全快速檢測(cè)工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，江蘇蘇州215008;2.蘇州市吳江區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，江蘇蘇州215200;3.蘇州市吳江區(qū)農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，江蘇蘇州215200)

近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問(wèn)題日益受到全世界的關(guān)注。據(jù)報(bào)道2012年我國(guó)進(jìn)口了5838萬(wàn)t大豆，其中絕大部分都是轉(zhuǎn)基因大豆，我國(guó)大豆加工的最大行業(yè)是浸油業(yè)，因此大豆油的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)十分重要。大豆油在得到粗油后有較為復(fù)雜的精煉過(guò)程，包括沉降、脫膠、脫酸、脫色、脫臭、脫蠟和脫致癌物等，僅沉降和脫膠兩個(gè)步驟就除去大豆粗油中絕大多數(shù)的 DNA［1－2］。高質(zhì)量 DNA 模板的獲取，是轉(zhuǎn)基因大豆油進(jìn)行檢測(cè)的前提。最常用檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的方法是基于DNA的檢測(cè)技術(shù)，基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)并不適用于分析檢測(cè)深加工食品［3］。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)大豆油是否含有轉(zhuǎn)基因成分主要檢測(cè)的基因有35S、NOS、CTP、CP4EPSPS 及其物種轉(zhuǎn)化事件特異性基因。巢式及半巢式PCR技術(shù)可以使檢測(cè)的下限下降幾個(gè)數(shù)量級(jí)，故在DNA殘留量微少的轉(zhuǎn)基因大豆油檢測(cè)中被成功使用［4－5］。單管巢式PCR是在普通PCR和巢式PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種PCR技術(shù)，目前在醫(yī)學(xué)，獸醫(yī)學(xué)的微量DNA檢測(cè)方面應(yīng)用較多［6－9］，但在轉(zhuǎn)基因大豆油檢測(cè)中未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)先用從轉(zhuǎn)基因大豆中提取出的高質(zhì)量大豆DNA為模板，利用針對(duì)轉(zhuǎn)基因Roundup Ready大豆外源基因設(shè)計(jì)的2條引物進(jìn)行溫度梯度PCR，篩選出內(nèi)外兩輪擴(kuò)增的最佳退火溫度，在此退火溫度基礎(chǔ)上對(duì)采用兩種不同方法從食品精煉大豆油中提取的DNA進(jìn)行單管巢式PCR檢測(cè)，并成功檢測(cè)到了轉(zhuǎn)基因成分，為轉(zhuǎn)基因大豆油的檢測(cè)提供了一種快速，方便，敏感度高的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

從阿根廷進(jìn)口的含CaMV35s啟動(dòng)子、CP4EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因Roundup Ready大豆、陰性大豆 蘇州吳江區(qū)農(nóng)委饋贈(zèng);轉(zhuǎn)基因大豆精煉油 金龍魚(yú)精煉一級(jí)大豆油;DNA提取試劑盒 上海博耀生物科技有限公司;TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Ladder 上海生工生物工程有限公司;引物 金唯智生物科技有限公司合成;PCR儀 Mastercycler ep Eppendorf中國(guó)有限公司;Biorad GelDoc XR伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CTAB法提取大豆基因組DNA 分別稱取陰性大豆、轉(zhuǎn)基因Roundup Ready大豆0.3g加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5mL離心管中，加入1.8mL CTAB提取液 I，2.0mL CTAB提取液Ⅱ，5μL巰基乙醇混勻，于65℃水浴30min，其間不停的振蕩，冷卻后加入 1.5mL 的酚/氯仿/異戊醇，混勻，13000r·min－1離心10min;取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，13000r·min－1離心 10min;取上清，加入 0.8 倍體積的異丙醇，混勻13000r·min－1離心 10min;取沉淀，用70%的乙醇洗2次，自然干燥，150μL TE溶解，待用。

1.2.2 改良試劑盒法提取精煉大豆油中的DNA 分別取6mL待檢油于三角瓶中，加入3mL的TE緩沖液和潔凈轉(zhuǎn)子，在磁力攪拌器上攪拌0.5h。轉(zhuǎn)至10mL 離心管中，12000r·min－1離心 20min，棄油相，在1.5mL離心管中加入0.5mL水相。加入0.6mL溶液A，室溫振蕩3～5min。將溶液全部轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置 2min。12000r·min－1室溫離心 1min，棄收集管中穿透液。加入0.8mL通用洗柱液到離心吸附柱中，12000r·min－1室溫離心 1min，棄收集管中穿透液。12000r·min－1室溫離心30s。在離心吸附柱的濾膜的中部加入30μL通用洗脫液，然后將離心吸附柱套入一新的1.5mL離心管中，室溫放置10min。12000r·min－1室溫離心1min，離心管中收集的樣品即為大豆精煉油DNA。

1.2.3 冷凍干燥法提取大豆毛油、精煉大豆油中的DNA 參照白立群等［10］分別取添加了2μg大豆DNA的大豆毛油和精煉大豆油20mL于50mL離心管中，加20mL無(wú)菌水，震蕩40min，5000×g離心30min，小心將水相轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放于－80℃冷凍過(guò)夜，然后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至真空干燥機(jī)中至水分完全蒸發(fā)，加2mL CTAB提取緩沖液至培養(yǎng)皿，65℃溫浴10min，用CTAB提取緩沖液小心仔細(xì)地反復(fù)沖洗培養(yǎng)皿，將沖洗液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，400μL/管，加1μL 2.5%線性丙烯酰胺，1/10體積的3.2mol/L NaAc，1mL 無(wú)水乙醇，混勻，－20℃放置 1h，15000g 離心10min去除上清液，加400μL無(wú)菌水充分溶解沉淀，15000g離心10min去除上清液，70%乙醇洗沉淀1次，晾干，加100μL無(wú)菌水充分溶解沉淀，備用。

1.3 PCR引物序列

單管巢式PCR引物設(shè)計(jì)在Primer Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件上對(duì)引物序列做了一些改動(dòng)。外源基因及內(nèi)源基因擴(kuò)增引物位置見(jiàn)圖1，引物序列及擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。

1.4 單管巢式PCR反應(yīng)體系構(gòu)建及反應(yīng)條件

圖1 單管巢式PCR引物位置圖片F(xiàn)ig.1 Positions of primers in Single－tube nested PCR

內(nèi)源基因Lectin擴(kuò)增:采用25μL體系，在PCR管中依次加入 ddH2O 12.25μL，10 ×PCR Buffer 2.5μL，3mmol/L dNTP 2μL，10pmol/L 的 Lectin－Fout和 Lectin－Rout各 1μL，150pmol/L 的 Lectin－Fin 和Lectin－Rout各 2μL，DNA 模板 2μL，TaqDNA 聚合酶0.25μL。循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性4min;接外循環(huán)94℃變性 25s，56℃ 退火 25s，72℃ 延伸 30s，25 個(gè)循環(huán);接內(nèi)循環(huán)94℃變性25s，45℃退火30s，72℃延伸30s，30 個(gè)循環(huán);后延伸 5min。

表1 單管巢式PCR所用的引物名稱、引物序列及擴(kuò)增片段大小Table 1 Information of primers in Single－tube nested PCR

外源基因CP4EPSPS擴(kuò)增:采用25μL體系，在PCR管中依次加入 ddH2O 12.25μL，10×PCR Buffer2.5μL，3mmol/L dNTP 2μL，5pmol/L 的CP4EPSPS－Fout和 CP4EPSPS－Rout各 1μL，150pmol/L的 CP4EPSPS－Fin和 CP4EPSPS－Rout各2μL，DNA 模板 2μL，TaqDNA 聚合酶 0.25μL。循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性4min;接外循環(huán)94℃變性25s，62℃退火 25s，72℃ 延伸 30s，25 個(gè)循環(huán);接內(nèi)循環(huán)94℃變性 25s，51℃ 退火 30s，72℃ 延伸 30s，30 個(gè)循環(huán);后延伸5min。

1.5 單管巢式PCR退火溫度的優(yōu)化

為優(yōu)化單管巢式PCR反應(yīng)，對(duì)內(nèi)外引物最適退火溫度進(jìn)行篩選。對(duì)兩段預(yù)擴(kuò)增片段的外引物進(jìn)行溫度梯度PCR，溫度梯度設(shè)為9℃，在外引物退火溫度的基礎(chǔ)上對(duì)內(nèi)引物進(jìn)行溫度梯度PCR，溫度梯度設(shè)為9℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)外引物進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，篩選最佳退火溫度

兩段DNA片段內(nèi)外引物梯度PCR擴(kuò)增，均以轉(zhuǎn)基因Roundup Ready大豆為材料。圖2、圖3分別為內(nèi)源基因Lectin和外源基因CP4EPSPS外引物退火溫度梯度PCR結(jié)果。

圖2 內(nèi)源基因Lectin PCR外引物最佳退火溫度篩選Fig.2 Screening of Lectin gene outer primer optimal annealing temperature

圖3 外源基因CP4EPSPS PCR外引物最佳退火溫度篩選Fig.3 Screening of CP4EPSPS gene outer primer optimal annealing temperature

由圖2、圖3可以看出，隨著退火溫度的變化，產(chǎn)物量也發(fā)生變化，其中圖2中55℃時(shí)條帶最亮，圖3中62℃時(shí)條帶最亮，故通過(guò)梯度PCR溫度篩選得到內(nèi)源基因Lectin和外源基因CP4EPSPS外引物的最佳退火溫度分別為:55、62℃。

2.2 對(duì)內(nèi)引物進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，篩選最佳退火溫度

圖4、圖 5內(nèi)源基因 Lectin和外源基因CP4EPSPS內(nèi)引物退火溫度梯度PCR結(jié)果。

通過(guò)圖4、圖5的梯度PCR得到內(nèi)源基因Lectin和外源基因CP4EPSPS內(nèi)引物的最佳退火溫度分別為:45℃和51℃，兩對(duì)基因外引物與內(nèi)引物之間的溫度差分別為10℃和11℃，在單管巢式PCR體系中，第一輪擴(kuò)增只允許外引物復(fù)性、擴(kuò)增，而內(nèi)引物不能與模板復(fù)性，故一般外引物退火溫度較高，第二輪擴(kuò)增采用較低的退火溫度，實(shí)現(xiàn)以內(nèi)引物介導(dǎo)的第二輪擴(kuò)增。故在單管巢式PCR實(shí)驗(yàn)中，一般采用先固定外引物退火溫度，在此基礎(chǔ)上篩選內(nèi)引物退火溫度的方法提高單管巢式PCR實(shí)驗(yàn)的特異性和重復(fù)性。

2.3 單管巢式PCR擴(kuò)增

圖4 內(nèi)源基因Lectin PCR內(nèi)引物最佳退火溫度篩選Fig.4 Screening of Lectin gene inner primer optimal annealing temperature

圖5 外源基因CP4EPSPS PCR內(nèi)引物最佳退火溫度篩選Fig.5 Screening of CP4EPSPS gene inner primer optimal annealing temperature

使用內(nèi)源基因Lectin和外源基因CP4EPSPS各自的內(nèi)外引物最佳退火溫度為條件，非轉(zhuǎn)基因的陰性大豆作為對(duì)照，無(wú)條帶產(chǎn)生。改良試劑盒法和冷凍干燥法提取大豆精煉油DNA為模板進(jìn)行單管巢式PCR反應(yīng)，獲得的片段長(zhǎng)度為396、300bp，與預(yù)期結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)采用改良試劑盒法，通過(guò)延長(zhǎng)水相乳化的時(shí)間和延長(zhǎng)通用洗脫液醇類與DNA共沉淀的時(shí)間來(lái)提高DNA提取的質(zhì)量，另外本實(shí)驗(yàn)還在預(yù)處理時(shí)采用冷凍干燥法［10］對(duì)大豆油進(jìn)行濃縮，使微量DNA濃度提高到沉淀劑作用范圍，兩種方法提取出的DNA都能滿足單管巢式PCR的擴(kuò)增要求，且條帶清晰。在對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆油進(jìn)行單管巢式PCR前先篩選過(guò)內(nèi)外引物的最佳退火溫度，故PCR結(jié)果無(wú)非特異性條帶產(chǎn)生。

圖6 內(nèi)源基因Lectin單管巢式PCRFig.6 Single－tube nested PCR of Lectin gene

圖7 外源基因CP4EPSPS單管巢式PCRFig.7 Single－tube nested PCR of CP4EPSPS gene

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的單管巢式PCR 4條引物，分別位于花椰菜花葉病35s啟動(dòng)子，葉綠素轉(zhuǎn)移肽基因CTP及草甘膦基因CP4EPSPS區(qū)域，針對(duì)的是特異轉(zhuǎn)化的外源基因。常規(guī)的巢式PCR方法一般將第1次PCR的產(chǎn)物取出加入到第2次PCR的反應(yīng)體系中，該法操作煩瑣、費(fèi)時(shí)，容易造成污染，本實(shí)驗(yàn)采用2次PCR的4個(gè)引物置于同一PCR管中進(jìn)行擴(kuò)增，但一次性加入引物的單管巢式PCR方法對(duì)內(nèi)外引物的退火溫度有特殊要求，即外引物的退火溫度高，內(nèi)引物的退火溫度低，在引物設(shè)計(jì)時(shí)就加以注意，并在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了內(nèi)外引物的最佳退火溫度篩選，故反應(yīng)條帶異性強(qiáng)，重復(fù)性高。本實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因精煉一級(jí)大豆油為原料提取DNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的單管巢式PCR檢測(cè)，靈敏度高、特異性強(qiáng)，且快速方便，為轉(zhuǎn)基因大豆精煉油的檢測(cè)提供了新方法。

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