波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥技術研究

任增超，陳 忻

(1.廣東興億海洋生物工程有限公司，廣東廣州510000;2.佛山科學技術學院，廣東佛山528000)

海洋由于其特殊的生活環境，蘊藏著豐富的優質蛋白質、功能肽、糖蛋白、氨基酸等生理活性物質。近年來，從海洋貝類資源中提取的具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫、抗氧化等保健功能［1－5］的蛋白水解物，已被越來越多的人所認識，逐漸成為研究開發的熱點，市場上包括食品、臨床營養品、保健品、生物醫藥以及功能化妝品等領域［6－8］對具有特殊生理功能的產品需求日益旺盛。海洋貝類資源在深加工過程中尤其是酶解提取蛋白［9］、功能肽［10］的過程中往往會產生較重的苦味和腥味［11］，這些問題的存在已成為海洋貝類酶解產物在食品、臨床營養品、保健品、生物醫藥、功能化妝品等領域中應用的主要限制因素。波紋巴非蛤(paphia undulate)是我國一類重要的海洋經濟貝類，是我國沿海居民經常食用的一種海產貝類，其蛋白質含量極高，富含呈味物質、牛磺酸、硒、鋅等［12－14］。目前，除大部分食用外，深加工比例相對較少。本文研究了鹽析法(NaCl)［15］、菊花茶掩蔽［16］、活性炭吸附［17］、β－環糊精包埋［18］4 種方法對波紋巴非蛤進行脫腥除味效果，為波紋巴非蛤的精深加工提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

波紋巴非蛤 佛山山紫市場;400目活性炭(食品級) 上海生化試劑廠;食鹽(食品級) 廣東省鹽業總公司;菊花茶(食品級) 湖南省衡陽市先鋒偉業農貿有限公司;β－環糊精(食品級) 山西九洲集團陽泉貿易有限責任公司;木瓜蛋白酶(8×104U/g) 廣西南寧龐博生物。

精密電子天平BL－6205 上海市島津制作所;水浴鍋HH.S21－6 上海躍進醫療器械廠;集熱式磁力攪拌器DF－1 金壇市新一佳儀器廠;電動攪拌器JJ－1 江蘇省金壇市環宇科學儀器廠;酸度計pH S－25 上海偉業儀器廠;高速冷凍離心機CR22G 日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 波紋巴非蛤酶解蛋白制備工藝 波紋巴非蛤→預處理(去殼，取其軟體部分、清洗、瀝干、絞碎)→分裝(200g/袋)→－18℃冷凍備用→取樣解凍(4℃過夜)→加水(料∶水=1∶0.5)→預熱到60℃，調pH7.0→加木瓜蛋白酶→滴加NaOH標準溶液維持pH7.0(pH－stat法［19］測定和控制水解度)→反應達到所需的水解度后滅酶(沸水浴，15 min)→離心(10000×g，4℃，15min)→過濾→波紋巴非蛤蛋白酶解液。

1.2.2 脫腥方法 鹽析法:取30mL配制好的濃度為5.0%的NaC1溶液加入到波紋巴非蛤蛋白酶解液(10g)中，充分攪拌均勻之后，在40℃下恒溫放置30min，冷卻至室溫，然后經2000r/min離心10min，取上清液，最后進行感官評定。

菊花茶掩蔽法:取30mL配制好的濃度為2.0%的菊花茶溶液加入到波紋巴非蛤蛋白酶解液(10g)中，充分攪拌均勻之后，放入75℃恒溫水浴鍋中浸泡30min，冷卻至室溫，然后經2000r/min離心10min，取上清液，最后進行感官評定。

活性炭吸附法:取30mL配制好的濃度為1.0%的活性炭溶液加入到波紋巴非蛤蛋白酶解液(10g)中，充分攪拌均勻之后，在30℃下恒溫放置40min，冷卻至室溫，然后經2000r/min離心10min，取上清液，最后進行感官評定。

β－環糊精包埋法:取30mL配制好的濃度為0.5%的β－環糊精水溶液，攪拌下緩慢滴入波紋巴非蛤蛋白酶解液(10g)中，30℃下恒溫放置60min，冷卻至室溫，然后經2000r/min離心10min，取上清液，最后進行感官評定。

1.2.3 活性炭脫腥方案優化實驗 本文在前期預實驗的基礎上確定了活性炭對脫腥效果的影響因素，進行單因素實驗，以腥味值為實驗評價指標，分別固定溫度和作用時間，考察活性炭添加量(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥效果的影響;固定添加量和作用時間，考察溫度(10、20、30、40、50、60、70℃)對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥效果的影響;固定添加量和溫度，考察作用時間(10、20、30、40、50、60min)對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥效果的影響，在此基礎上通過正交實驗法優化合成脫腥工藝的工藝條件，正交實驗L9(34)因素水平如表1。

表1 活性炭作用條件正交實驗因素水平表Table 1 The levels and factors of the orthogonal test

1.2.4 腥味評分標準 原波紋巴非蛤酶解蛋白的腥味值定為5，將其與脫腥劑作用后的波紋巴非蛤酶解蛋白作腥味比較，確定經脫腥劑作用后的酶解蛋白的腥味值。脫腥劑作用后其腥味值的評分標準如表2所示。

表2 腥味值評分標準Table 2 Criteria for evaluate on fishy smell

1.2.5 各種脫腥劑的優化實驗中的感官評定方法參照文獻［20］，采用先聞后吃的方式進行感官評定，由20名經系統培訓和實際經驗的初級評價員組成評審小組，根據腥味的大小打分，分數分別為5、4、3、2、1，計算樣品的總分。

2 結果與討論

2.1 不同脫腥劑脫腥效果的比較結果

本文在前期實驗研究基礎上，分別用NaCl、菊花茶、活性炭、β－環糊精等不同脫腥劑對波紋巴非蛤酶解蛋白進行脫腥除味效果的比較，實驗結果如表3所示。

由表3可以看出，菊花茶的脫腥效果最佳，活性炭次之，β－環糊精、NaCl最小。由于在菊花茶脫腥的過程中，菊花茶的味道完全掩蓋了波紋巴非蛤的呈味成分所有的味道，所以，雖然其脫腥效果最佳，但菊花茶的味道太重，不適于后續實驗。而相對其它脫腥劑來說，活性炭脫腥效果較其它脫腥劑好，活性炭的添加量、溫度、時間對脫腥效果影響較大，所以選擇活性炭作脫腥劑進行正交實驗較為合適。

表3 不同脫腥劑對脫腥除味的影響Table 3 The effect of the different deodorization agents on the fishy smell

2.2 活性炭脫腥結果和討論

2.2.1 活性炭用量對脫腥除味效果的影響 本實驗把波紋巴非蛤酶解蛋白恒溫 30℃，作用時間為40min，實驗活性炭用量對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥效果的影響，實驗結果如圖1所示。

圖1 活性炭的添加量對脫腥除味的影響Fig.1 The effect of the dosage of active carbon on the fishy smell

由圖1可知，當活性炭添加量較小時，波紋巴非蛤酶解蛋白的脫腥效果隨著活性炭用量的增加有較大的增幅;當活性炭的添加量超過3.0%之后，隨活性炭用量的增加，酶解蛋白的脫腥效果沒有明顯提高，且隨著添加量的增大會造成較大波紋巴非蛤酶解蛋白的損失，確定活性炭的用量為3.0%。

2.2.2 作用溫度對活性炭脫腥除味效果的影響 添加3.0%的活性炭，作用時間為40min，實驗活性炭作用溫度對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥除味的影響，實驗結果如圖2所示。

圖2 活性炭溫度對脫腥除味的影響Fig.2 The effect of the temperature of active carbon on the fishy smell

由圖2可知，隨著溫度的升高，波紋巴非蛤酶解蛋白的腥味值下降，原因可能是隨著溫度的升高，活性炭作用體系內分子劇烈運動，與波紋巴非蛤酶解蛋白充分接觸，有利于腥味成分充分融入到活性炭的空隙結構中，提高了吸附效率。當然不排除隨著溫度的升高部分揮發性醛酮的揮發進一步降低了波紋巴非蛤酶解蛋白本身的腥味。進一步升溫，活性炭對波紋巴非蛤酶解蛋白的脫腥效果反而下降，這與活性炭吸附效能是一致的。綜合考慮確定活性炭吸附溫度為50℃。

2.2.3 活性炭作用時間對脫腥除味效果的影響 本實驗在添加3.0%的活性炭，作用溫度在50℃的條件下，研究活性炭作用時間對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥除味的影響，實驗結果如圖3。

圖3 活性炭作用時間對脫腥除味的影響Fig.3 The effect of the operated time of active carbon on the fishy smell

由圖3可以看出，前30min，活性炭與波紋巴非蛤酶解蛋白接觸，腥味值變化不大，在吸附作用30min后，腥味值下降明顯;吸附40min之后，脫腥效果變化不明顯。實驗結果說明，活性炭處理酶解蛋白40min后基本達到飽和，因此，初步確定作用時間為40min。

2.2.4 活性炭最佳吸附條件的確定 在上述單因素實驗結果的基礎上，以腥味值為實驗評價指標，建立正交優化實驗，對活性炭的添加量、作用溫度、作用時間進行優化，實驗結果如表4所示。

表4 正交實驗結果Table 4 The result of the orthogonal experiment

從表4可知，活性炭吸附作用條件各因素的最佳組合為A2B1C2，即活性炭添加量為3.0%，作用溫度為40℃，作用時間為35min的條件下所得的脫腥效果最佳，經實驗測得其脫腥值為2。極差分析可知，活性炭吸附作用的三個因素對結果影響的大小依次為:添加量影響最大，溫度次之，時間最小。

驗證實驗表明，最佳條件下活性炭對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥值為2，達到了實驗優化目的。

3 結論

較為詳細地研究了活性炭的吸附作用對波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥除味的影響。通過單因素實驗及正交實驗方案確定活性炭對波紋巴非蛤酶解蛋白的最佳吸附條件:活性炭添加量為3.0%，作用溫度為40℃，作用時間為35min。

在擬定的活性炭最佳吸附條件下，波紋巴非蛤酶解蛋白脫腥效果顯著，與原波紋巴非蛤酶解蛋白相比較，其腥味明顯減弱。

［1］Brad K，Carté.Biomedical Potential of Marine Natural Products［J］.Marine Biotechnology，1996，46(4):271－286.

［2］吳杰連，朱學春，吳梧桐.海洋貝類抗癌免疫活性的研究進展［J］.水利漁業，2006，26(3):16－18.

［3］王竹清，李八方.生物活性肽及其研究進展［J］.中國海洋藥物，2010，29(2):60－68.

［4］Sarmadi BH，Ismail A.Antioxidative peptides from food proteins:a review［J］.Peptides，2010，31(10):1949－1956.

［5］林麗云，孫恢禮，肖婉娜.波紋巴非蛤活性肽的酶法提取及其抗氧化性研究［J］.安徽農業科學，2010，38(20):10901－10902，10909.

［6］方富永，苗艷麗，宋文東.波紋巴非蛤肉復合酶水解工藝及功能口服液的研制［J］.食品科學，2009，30(18):412－415.

［7］Aneiros A，Garateix A.Bioactive peptides from marine sources:pharmacological properties and isolation procedures［J］.J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci，2004，803(1):41－53.

［8］Tidona F，Criscione A，Guastella AM，et al.Bioactive peptidesin dairy products［J］.Italian Journal of Animal Science，2009，8(3):315－340.

［9］吳園濤，孫恢禮.海洋貝類蛋白資源酶解利用［J］.中國生物工程雜質，2007，27(9):120－125

［10］繆輝南，方旭東.海洋生物資源開發研究慨況與展望［J］.氨基酸和生物資源，1999，21(4):12－18.

［11］許秀娟，鐘紅茂，蔣仙瑋.水產制品除腥技術研究進展［J］.中國食物與營養，2009(2):32－35.

［12］王茵，劉淑集，蘇永昌，等.波紋巴非蛤的形態分析與營養成分評價［J］.南方水產科學，2011，7(6):19－25.

［13］吳紅棉，范秀萍，雷曉凌，等.波紋巴非蛤氨基多糖的分離純化及其理化性質的初步研究［J］.食品與發酵工業，2005(7):133－136.

［14］章超樺，洪鵬志，雷曉凌，等.波紋巴非蛤肉的食品化學特性及其在魚糜制品中的應用［J］.湛江海洋大學學報，2000，20(1):28－32.

［15］陳奇，黃壽恩.魚制品脫腥工藝的研究［J］.食品科學，2007，28(6):163－167.

［16］單聯剛.三種茶對用于飲料制作的海帶浸提液脫腥效果的研究［J］.飲料工業，2009(10):11－12.

［17］李前山，蘇媛媛.貽貝酶解液用酵母發酵法脫腥效果最佳［J］.監督與選擇，2008(6):60－62.

［18］宋永相，孫謐，王海英.海洋活性膠原肽酶解液的脫色脫腥工藝［J］.水產學報，2008，32(5):804－810.

［19］Adler－Nissen J.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins［M］.London:Elsevier Applied Science Publishers Ltd，1986:132－133.

［20］吳謀成.食品分析與感官評定［M］.北京:中國農業出版社，2002.