蘇芡種殼棕色素的提取及紅外光譜分析

張曉云，盧 昊，王海剛，翟鑫宇，鄭漓波，張雪婧

(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013)

蘇芡又名“南芡”、“南蕩雞頭”等，為睡蓮科芡屬無刺芡栽培種，原產于我國江蘇省蘇州市。與北芡(刺芡)相比，其種仁粒大、圓整，煮食糯性、營養豐富、產量高，具有較高的經濟價值，是目前國內唯一的優質芡實栽培品種。據不完全統計，我國“蘇芡”栽種面積已超過10萬畝［1］。目前，對蘇芡產品的研究開發主要是一些粗加工的芡實米、芡實醬菜和以芡實莖根作原料的食用蔬菜［2］，對其堅硬種殼(約占其種子質量的30%～40%)的開發利用尚很欠缺，通常情況下被廢棄或作普通燃料，不僅浪費資源，而且污染環境。研究表明，芡實種殼中含有較多的棕色素，其主要成分通常為多元酚類物質［3］;而多酚類物質由于特有的分子結構和化學特性使其具有抗腫瘤、抗氧化以及抗菌等多種生理功能［4－5］，已廣泛被應用于醫學、食品、日用化工等相關領域［6］。本文以蘇芡種殼為原料，選擇合適的溶劑提取其棕色素，經分離純化后分別用紅外光譜儀對其結構進行測定分析，為今后進一步綜合開發利用蘇芡資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇芡種殼 購自蘇州，經40℃烘干后用超微粉碎機粉碎過80目篩后備用;鹽酸、NaOH、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等 均為分析純。

TGL－16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;SHZ－10組合式水浴搖床 太倉市實驗設備廠;GZX－9240 MBE數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;Cary 100紫外可見分光光度計 美國瓦里安公司;ATAVAR型傅立葉變換紅外(FT－IR) 美國Nicolet公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 棕色素提取劑的選擇 分別稱取1.0g粉碎蘇芡種殼，按照料液比1∶25加入蒸餾水、1%HCl、2%NaOH、50%乙醇、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等不同提取劑，室溫下振蕩提取2h后經10000r/min離心10min，收集上清液定容至250mL備用。

將上述不同棕色素提取液分別通過全波長掃描確定其最大吸收波長，然后測定各提取液(稀釋5倍)在其最大吸收波長處的吸光度，進行比較。

1.2.2 棕色素提取條件的優化

1.2.2.1 料液比對提取效果的影響 準確稱取1.0g粉碎蘇芡種殼，分別按照料液比(蘇芡種殼:2%NaOH)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 于錐形瓶中60℃下振蕩提取2h后，經10000r/min離心10min。收集上清液定容至250mL，再稀釋10倍于419nm處測定其吸光度。

1.2.2.2 時間對提取效果的影響 準確稱取1.0g粉碎蘇芡種殼，按照料液比(蘇芡種殼∶2%NaOH)1∶25加入錐形瓶中。在60℃條件下分別振蕩提取1、2、3、4、5、6h，經 10000r/min 離心 10min。收集上清液定容至250mL，再稀釋10倍于419nm處測定其吸光度。

1.2.2.3 溫度對提取效果的影響 準確稱取1.0g粉碎蘇芡種殼，按照料液比(蘇芡種殼∶2%NaOH)1∶25加入錐形瓶中。在 30、40、50、60、70、80℃條件下分別振蕩提取2h，經10000r/min離心10min。收集上清液定容至250mL，再稀釋10倍于419nm處測定其吸光度。

1.2.2.4 最佳提取工藝條件的確定 選取溫度、時間、料液比為考察因素，每個因素取3個水平(見表1)，用L9(34)正交表安排實驗，對棕色素提取條件進行優化設計，篩選最佳工藝。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.3 棕色素的純化與紅外光譜分析

1.2.3.1 棕色素粗制品的制備與純化 稱取100g粉碎蘇芡種殼，按照料液比 1∶30(蘇芡種皮∶2%NaOH)，60℃下振蕩提取3h后經10000r/min離心分離10min。將上清液經減壓濃縮后分兩等份分別經方法Ⅰ(酸沉法)和方法Ⅱ(醇沉法)進行純化處理［7］。

方法Ⅰ:取上述棕色素粗提取液于離心管中，邊搖邊滴加3mol/L HCl至出現渾濁時，放置冰箱中1h，經10000r/min離心分離10min。向得到的沉淀物滴加0.1mol/L NaOH至沉淀剛溶解，如此重結晶三次。將沉淀物于50℃干燥，得純化棕色素Ⅰ。

方法Ⅱ:取上述棕色素粗提取液于離心管中，邊搖邊滴加無水乙醇，直至棕色素溶液沉淀完全時置于冰箱中充分沉淀1h，經10000r/min離心分離10min。將沉淀物于50℃干燥，得純化棕色素Ⅱ。

1.2.3.2 棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的紅外光譜分析 分別取適量經105℃干燥6h后的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ，加入無水溴化鉀粉末，用研缽充分磨細、混勻、裝模，置于壓片機上抽真空2min，加壓至100000N/cm2，受壓10min，把樣品壓成0.1～1.0mm厚的芯片。將芯片置于紅外光譜儀的樣品光路中，波數范圍為400～4000cm－1，記錄其IR數據。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑對棕色素提取效果比較

為準確比較甲醇、乙酸乙酯、乙醇、鹽酸等不同提取劑對蘇芡種殼中棕色素的提取效果，分別測定各不同溶劑提取液在其最大吸收波長處的吸光度，結果見表2所示。

表2 不同溶劑提取棕色素的吸光度比較Table 2 Adsorption of different solvents on extraction of brown pigment

由表2可以看出，用2%NaOH溶液對蘇芡種殼中棕色素的提取效果最好，其次是水和50%乙醇，甲醇、乙酸乙酯、無水乙醇、1%鹽酸對蘇芡種殼棕色素的提取能力較差。綜合考慮，選擇2%NaOH溶液為提取劑。

2.2 各因素對棕色素提取效果的影響

2.2.1 料液比對提取效果的影響 如圖1所示，增加料液比可顯著提高對蘇芡種殼棕色素的提取效果，但料液比增加到1∶25以后，繼續增加料液比不能帶來提取效果的顯著性增加。所以從提取效果和節約成本兩方面考慮，確定料液比在1∶20～1∶30比較適宜。

圖1 料液比對棕色素提取效果的影響Fig.1 Influence of material－liquid ratio on the extraction effect of brown pigment

2.2.2 提取時間對提取效果的影響 由圖2可以看出，提取時間在2h內，提取液吸光度隨著時間延長增加;當提取時間超過2h，吸光度隨著提取時間的增加反而出現下降趨勢。這可能是由于棕色素在該提取條件下不穩定，隨著提取時間增加出現了少量分解所致［8］。因此，選擇提取時間為2h左右較為適宜。

圖2 提取時間對棕色素提取效果的影響Fig.2 Influence of extracting time on the extraction effect of brown pigment

2.2.3 提取溫度對提取效果的影響 如圖3所示，隨著提取溫度的升高，提取液吸光度值增加，但超過40℃后吸光度值增加幅度減小。根據文獻［9－10］研究報道，棕色素在溫度80℃以上時不穩定，可能會導致色素分子結構發生不可逆的變化。因此，提取溫度選擇在40～60℃。

圖3 提取溫度對棕色素提取效果的影響Fig.3 Influence of extracting temperature on the extraction effect of brown pigment

2.2.4 色素最佳提取條件的確定 按照表1因素水平條件進行正交實驗，結果如表3所示。由表3可以看出，各因素對蘇芡種殼中棕色素提取效果的影響順序為:提取溫度＞提取時間＞料液比。實驗條件A3B3C2即提取溫度為60℃、提取時間為3h、料液比為1∶25對蘇芡種殼中棕色素的提取效果較好。為進一步確認棕色素的最佳提取條件，根據單因素實驗和正交實驗的分析結果，選取實驗條件 A3B3C2和A3B3C3進行驗證，實驗結果表明A3B3C2條件下蘇芡種殼棕色素提取液的吸光度值為0.860，A3B3C3條件下的吸光度值為0.871。綜合考慮，確定蘇芡種殼中棕色素的最適提取條件為 A3B3C3，即提取溫度為60℃、提取時間為 3h、料液比為 1∶30。

表3 正交實驗結果分析Table 3 Result analysis of orthogonal experimental design

2.3 蘇芡種殼棕色素的紅外光譜分析

圖4是經酸沉法和醇沉法得到的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的紅外光譜圖。由圖4可見，兩種棕色素的波形和波數存在一定差異。二者在3390.30cm－1處均有一個較強的吸收峰，這是酚類物質的重要特征，是由O－H伸縮振動引起的吸收峰;在 1633.44、1456.02、1338.38cm－1均出現略強的吸收峰，其中1633.44cm－1處為芳香環的伸縮振動峰;在3043.17、2989.17、1112.74、1051.31cm－1處均出現較小的吸收峰。二者差異主要在于:棕色素Ⅰ在 2925.53、2854.18、1716.36、1234.24cm－1處出現強弱不等的吸收峰，主要是亞甲基和酯羰基的伸縮振動峰，C－N和N－H的伸縮振動峰;棕色素Ⅱ在867.82、815.75、777.18cm－1處出現強弱不等吸收峰，主要是芳香環的一取代面外彎曲振動峰。

圖4 棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrogram of pigmentⅠand pigmentⅡ

紅外光譜分析可知，蘇芡種殼棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的結構中均存在芳香環，棕色素Ⅰ中存在著酯羰基結構，且具有C－N，而棕色素Ⅱ中不存在這些結構，但其芳香環上具有棕色素Ⅰ沒有的取代基。對于蘇芡種殼棕色素的具體主要組成，尚需進一步采用合適的方法如高效毛細管電泳、高效液相色譜法、高速逆流色譜、質譜和核磁共振譜等［11］對其主要成分進行進一步分離和結構確認。

3 結論

3.1 與50%乙醇、甲醇、乙酸乙酯、無水乙醇、1%鹽酸等提取劑相比，2%NaOH溶液對蘇芡種殼中棕色素的提取效果較好。在單因素實驗的基礎上，通過實驗綜合確定用2%NaOH溶液提取蘇芡種殼中棕色素的最佳條件為:料液比1∶30，提取溫度60℃，提取時間3h。

3.2 對提取的棕色素利用酸沉法和醇沉法分別進行純化處理得到的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ。紅外分析表明棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ結構中均存在芳香環。但棕色素Ⅰ中存在著酯羰基和C－N結構;而棕色素Ⅱ中不存在這些結構，其芳香環上具有棕色素Ⅰ沒有的取代基。對于蘇芡種殼棕色素的具體主要組成尚需進一步采用合適的方法進行分離和確認。

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