凍藏方式對(duì)豬肉肌原纖維蛋白氧化及凝膠特性的影響

潘君慧，劉澤龍

(1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州325005;2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，北京100020)

凍藏肉是目前肉類產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易和地區(qū)間流通的主要產(chǎn)品形態(tài)，也是我國(guó)肉制品未來(lái)發(fā)展的方向之一。在凍藏過(guò)程中，肉制品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、顏色會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的劣變。近年的研究證據(jù)顯示，除了脂質(zhì)的氧化，蛋白冷凍變性外，蛋白氧化也是導(dǎo)致凍藏肉品品質(zhì)劣化的重要原因［1－2］。在肉及肉制品中，肌原纖維蛋白作為主要蛋白質(zhì)，對(duì)肉蛋白功能尤其是凝膠性起主要作用。肌原纖維蛋白對(duì)活性氧的攻擊非常敏感，受氧化后其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著改變?nèi)缧纬傻鞍拙奂w等，而這些現(xiàn)象均會(huì)使蛋白質(zhì)的凝膠性發(fā)生較大變化［3］。因此，尋找合適的措施控制凍藏過(guò)程的氧化，并且保持凍藏肉肉品品質(zhì)和蛋白功能具有重要研究意義。本文從實(shí)際體系研究出發(fā)，主要討論了三種包裝處理的凍藏肉中肌原纖維蛋白的凝膠特性，以闡明儲(chǔ)藏方式對(duì)肌肉蛋白凝膠功能性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用肉 實(shí)驗(yàn)選取新鮮豬后腿肉(購(gòu)于當(dāng)?shù)貥?lè)購(gòu)超市，宰后1d)，經(jīng)過(guò)剔除筋膜后通過(guò)三遍切片機(jī)切片切丁(10mm×10mm×10mm)，混勻后取部分肉(或提取肌原纖維蛋白)作為空白進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，其余部分分裝后按三種方式包裝:1號(hào)處理為普通密封包裝、2號(hào)處理為混合添加抗壞血酸、α－生育酚和茶多酚(各0.2%，w/w)后進(jìn)行普通密封包裝、3號(hào)處理為真空密封包裝，樣品被放入－18℃冰箱儲(chǔ)藏放置24周，并在第2、4、8及24周各取樣約20 g進(jìn)行分析。

超純水 美國(guó)Millipore公司;2，4－二硝基苯肼(DNPH) 美國(guó)Sigma公司;其它試劑(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV－2800H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;BVPJ－500TS真空包裝機(jī) 嘉興艾博不銹鋼機(jī)械工程有限公司;DS－1高速組織搗碎機(jī) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;Avanti J－26 XP高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司;AR1000流變儀英國(guó)TA Instrument公司;T18 basic高速均質(zhì)機(jī) 英國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 凍藏肉在4℃經(jīng)過(guò)6h解凍，用5倍提取緩沖液(0.1mol/L NaCl，2mmol/L MgCl2，1mmol/L EDTA，10mmol/L K2HPO4，pH7.0)勻漿后離心(2000g，10min)，重復(fù)四次并在第四次離心前用四層紗布過(guò)濾并將pH調(diào)至6.0，最后得到的蛋白膏保存于冰盒中備用。蛋白濃度用雙縮脲法測(cè)定。

1.2.2 羰基的測(cè)定 參考Levine等人測(cè)定羰基含量的方法，讀取樣品在370nm下的吸光值，蛋白質(zhì)羰基衍生物的含量(nmol/mg蛋白)使用摩爾吸光系數(shù)為22000M－1cm－1計(jì)算［4］。

1.2.3 K－ATP酶活性的測(cè)定 參考Katoh等人［5］的方法，測(cè)定 K－ATPase酶活。酶活力表示為:μmol Pi/mg蛋白/10min。

1.2.4 蛋白凝膠流變學(xué)特性的測(cè)定 使用流變儀測(cè)定肌原纖維蛋白在程序升溫和降溫過(guò)程中凝膠形成所產(chǎn)生的力學(xué)變化。設(shè)定的主要參數(shù)是:采用4cm直徑的平板夾具，對(duì)混合蛋白進(jìn)行溫度掃描，以2℃/min的速率從20℃升至75℃，每個(gè)溫度點(diǎn)的平衡時(shí)間為30s，最大應(yīng)變力為0.02，單頻頻率為0.1Hz，狹縫為1mm。在平板夾具上蓋好保護(hù)蓋并滴加硅油密封后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 蛋白凝膠的制備 將5g濃度為30mg/mL肌原纖維蛋白溶液置于瓶底玻璃管中(50mm×20mm)離心(800g，1min，4℃)除去氣泡，然后置于恒溫水浴鍋中，從20℃開(kāi)始以1.2℃/min的速率升溫，至75℃時(shí)取出迅速置于冰浴中冷卻。

1.2.6 蛋白凝膠持水性 凝膠(約5g，記為W1)在4℃靜置過(guò)夜后，移至50mL的離心管中并記重(W2)，離心(10000g，15min，4℃)。倒掉離心出的水，將離心管倒置于鋪有吸水紙巾的桌面上，15min后稱重(W3)。蛋白凝膠持水性計(jì)算如下:

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均為2次重復(fù)3次平行。數(shù)據(jù)處理使用Statistix 9.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析(LSD法)，不同顯著性數(shù)據(jù)用不同字母標(biāo)記。

2 結(jié)果與討論

2.1 凍藏肉儲(chǔ)藏過(guò)程中蛋白羰基與酶活變化

由圖1中可見(jiàn)，普通密封包裝樣品的蛋白羰基含量均高于其他兩種處理方式;在儲(chǔ)藏8周內(nèi)，復(fù)合抗氧化劑的添加使得蛋白羰基維持在比較低的水平(p＞0.05)，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，由于抗氧化劑的消耗，蛋白羰基有所增加。另外，也還可能由于儲(chǔ)藏過(guò)程中抗壞血酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊摎淇箟难崤c肌肉中的微量過(guò)氧化氫和鐵離子形成金屬催化氧化體系，加劇了蛋白在儲(chǔ)藏后期的氧化［3，6］。而氧氣的去除(3號(hào))可以有效抑制儲(chǔ)藏期間蛋白羰基的生成(p＞0.05)。

圖1 凍藏及不同包裝處理對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of frozen storage on protein carbonyl content of myofibrillar protein in muscle by different packaging treatments

從圖2中可以看出，由于肌球蛋白頭部酶活性對(duì)氧化很敏感，1號(hào)和3號(hào)樣品的肌球蛋白的ATP酶活和文獻(xiàn)報(bào)道相一致:總體都呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，表明肌球蛋白頭部構(gòu)象的變化［7－8］。除氧化影響外，酶活的損失可能更多的與在冷凍和解凍過(guò)程中內(nèi)源蛋白酶類對(duì)肌球蛋白頭部水解有關(guān)［9］。在2號(hào)處理中，為抑制氧化而添加的復(fù)合抗氧化劑并未起到穩(wěn)定肌球蛋白構(gòu)象的作用，反而在儲(chǔ)藏前期，直接或者間接影響了肌球蛋白頭部活性區(qū)域的氨基酸殘基，抑制了肌球蛋白的ATP酶活。

圖2 不同包裝處理凍藏后對(duì)肌球蛋白K－ATP酶活性的影響Fig.2 Effect of different packaging treatments on myosin K－ATPase activity during 24－week frozen storage

2.2 凍藏后的肌原纖維蛋白凝膠流變特性

三種處理肉肌原纖維蛋白的流變學(xué)特征(彈性模量，G')見(jiàn)圖3。空白樣品的流變曲線顯示，在45～50℃有一次凝膠轉(zhuǎn)變，隨后在50～57℃有一個(gè)肩峰為第二次凝膠轉(zhuǎn)變。第一次凝膠轉(zhuǎn)變過(guò)程中，主要由于肌球蛋白重酶解肌球蛋白變性［10］，蛋白間的相互作用增強(qiáng)，蛋白開(kāi)始聚集，凝膠網(wǎng)絡(luò)開(kāi)始形成。G'在47～50℃的下降，主要原因在于肌球蛋白的輕酶解肌球蛋白部分發(fā)生變性，并導(dǎo)致了肌球蛋白絲流動(dòng)性的上升。隨著溫度繼續(xù)增加，肌球蛋白凝膠加速形成，肌動(dòng)蛋白變性增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度使得彈性模量持續(xù)上升。

圖3 三種處理樣品凍藏后肌原纖維蛋白凝膠的彈性模量變化Fig.3 Changes in storage modulus of myofibrillar protein gel made from three treatment samples during frozen storage

從圖3可以看出，經(jīng)過(guò)凍藏以后，三種樣品第一個(gè)凝膠轉(zhuǎn)變溫度的蛋白變性峰均有不同程度減弱，證實(shí)了在冷凍過(guò)程中肌球蛋白頭部均發(fā)生了部分變性。根據(jù)終貯能模量(終G')所示，樣品的凝膠能力均呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，以1號(hào)和2號(hào)樣品更為明顯。此外，通過(guò)圖3a與3c的比較，可以發(fā)現(xiàn)凍藏時(shí)間對(duì)3號(hào)樣品肌原纖維蛋白凝膠的流變特性影響不大，這也與圖1中蛋白羰基變幅不大相對(duì)應(yīng);而圖3a中不同時(shí)間的儲(chǔ)藏對(duì)蛋白凝膠的形成有明顯影響，由于1號(hào)樣品中未除去氧氣，可以斷定氧化是重要的影響因素。另外，肌球蛋白頭部的氧化并未影響凝膠最終強(qiáng)度，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道推斷凍藏過(guò)程中的肌球蛋白尾部的氧化影響了凝膠的終點(diǎn)彈性模量［10］。

2.3 凍藏后肌原纖維蛋白凝膠持水性

由圖4可見(jiàn)，在2～4周后，1號(hào)、2號(hào)樣品凝膠持水力相比空白樣品有顯著降低。已知蛋白凝膠通過(guò)毛細(xì)作用和蛋白水合作用束縛水分。雖然以上樣品由于蛋白氧化增強(qiáng)了肌原纖維蛋白的凝膠能力，但較高程度的氧化可能會(huì)破壞精細(xì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，反而降低了凝膠網(wǎng)絡(luò)束縛水分的能力［10］。在三種樣品中，2號(hào)樣品的凝膠持水性降低尤為顯著，這可能由于2.1中提到的脫氫抗壞血酸參與下的金屬催化氧化體系，以及形成了四價(jià)鐵血紅蛋白自由基而加速了蛋白肌原纖維蛋白氧化［3］。真空包裝樣品(3號(hào))在儲(chǔ)藏期內(nèi)的凝膠持水力變化幅度較小，且到24周還略有升高。這可能由于此時(shí)蛋白殘基的氧化修飾改變了蛋白表面電荷以及氫鍵，反而使肌原纖維蛋白的水合能力略有增加［11］。

圖4 凍藏后不同包裝處理肉的肌原纖維蛋白凝膠持水性Fig.4 Water holding capacity of myofibrillar protein gel from different treatment samples during frozen storage

3 結(jié)論

采用普通密封包裝以及添加復(fù)合抗氧化劑的的樣品隨著凍藏過(guò)程中氧化程度由輕到重，肌原纖維蛋白的凝膠能力均呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，但增強(qiáng)的凝膠能力并未改善凝膠的持水能力。其中，所用復(fù)合抗氧化劑在半年儲(chǔ)藏期內(nèi)抑制冷凍肉蛋白氧化以及保持肌原纖維蛋白功能方面尚未達(dá)到理想效果。真空包裝盡管在防止蛋白氧化，保持肌原纖維凝膠能力及持水性方面有較好效果，但已知該包裝技術(shù)會(huì)增加肉品的汁液損失［12］。因此，還需要進(jìn)一步研究抗氧化劑的復(fù)配，并尋找合適的措施綜合控制冷凍肉蛋白氧化及保持蛋白功能。

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