新疆家蠶抗菌肽對小鼠體征指標(biāo)和臟器組織影響的研究

康 蘇，夏麗潔，馬 紀(jì)，張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046)

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要活性物質(zhì)［1－2］，多數(shù)具有廣譜高效的抗菌［3－4］及抗癌［5－6］活性，是潛在的新型抗菌和抗腫瘤藥物。AMPs通常由12～50個氨基酸組成，包括2～3個Arg及Lys等正電荷氨基酸殘基，疏水性氨基酸比率較大(通常 ＞50%)［7］，AMPs作用活性依賴多肽結(jié)構(gòu)和酸堿環(huán)境［8］，多數(shù)AMPs通過影響細(xì)胞膜通透性殺滅病原菌［9－10］。因此，AMPs在食品防腐方面具有重要的應(yīng)用前景，如Nisin正逐步取代傳統(tǒng)食品添加劑［11－13］;隨著抗生素濫用和病原菌對抗生素耐藥性逐漸增強［14］，開發(fā)和設(shè)計 AMPs及其類似物作為對抗耐藥菌的抗菌藥物具有重要意義［15－16］。

Cecropin 是 AMPs 中的一類，由 Hultmark［17］在Hyalophora cecropia 中分離獲得，1981 年，Steiner［18］將這種具有抗菌活性的物質(zhì)命名為Cecropin?；贑ecropin的單鏈多肽結(jié)構(gòu)，可利用基因工程及肽合成技術(shù)進行工業(yè)化生產(chǎn)，并可通過化學(xué)修飾提高其抗菌和抗癌活性，減少細(xì)胞毒性［19－20］。新疆家蠶抗菌肽(CecropinXJ)基因從阿克蘇新蠶3號蠶體中克隆獲得，已在原核和真核系統(tǒng)成功表達［21－22］。CecropinXJ屬于天蠶素－B類家族，具兩親性α－螺旋區(qū)域，信號肽26個氨基酸，成熟肽37個氨基酸，具有強熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，抗菌譜廣，對多種癌細(xì)胞具細(xì)胞毒性作用［22－24］，在食品加工行業(yè)具有潛在應(yīng)用價值［25］。

一般情況下，多數(shù)AMPs對真核生物或細(xì)胞具有低毒性［26］:口服低劑量 Nisin(0.0125～125μg/kg/d)和高劑量Nisin(15～20mg/kg/d)后，對大鼠正常生長和組織形態(tài)學(xué)無明顯影響［27－28］，且在 10、25、50mg/kg/d劑量下，Nisin對實驗鼠無明顯致畸作用;細(xì)菌素Subticin112對小鼠體征指標(biāo)也無明顯影響［29］。關(guān)于CecropinXJ對實驗動物的影響仍未見報道，本研究擬通過觀察CecropinXJ對小鼠體重和臟器系數(shù)的影響，探討其對小鼠的毒副作用，為CecropinXJ抗菌產(chǎn)品研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆家蠶抗菌肽(CecropinXJ) 由本實驗室提供，蛋白濃度為2mg/mL;ICR小鼠 體重25g左右，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供。

Benchmark Plus酶標(biāo)儀 美國Bio－Rad公司;菲恰爾GL－12A離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司;JY92－2D超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;MP5002電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;Leica DFC4800倒置熒光顯微鏡 德國Leica公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 CecropinXJ的提取 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32a－CecropinXJ在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng);挑取單菌落接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/min過夜培養(yǎng);次日按1%體積比轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的新鮮培養(yǎng)基，37℃，200r/min震蕩培養(yǎng)菌液至 OD600為0.6～0.8;加入IPTG至終濃度為0.8mmol/L，37℃誘導(dǎo)5h;4℃，12000r/min，離心10min，收集菌體;PBS 洗滌菌體3遍后，重懸于PBS中，冰浴進行超聲波細(xì)胞破碎 5s，間歇 5s，200w，工作 30min;4℃，12000r/min，離心10min，取上清和沉淀進行Tricine－SDS－PAGE電泳檢測［30］。

1.2.2 CecropinXJ的純化 將超聲裂解后的上清液用0.22μm微孔濾膜過濾后，參照 Ni SepharoseTM6 Fast Flow說明書對帶有His標(biāo)簽的融合蛋白進行親和純化，取樣進行Tricine－SDS－PAGE電泳檢測，分析純化效果［30］。

1.2.3 實驗小鼠的飼養(yǎng)及灌胃 取體重25g左右的健康ICR雌鼠12只，隨機分成4組，每組3只。灌胃前2h稱重，平均值作為實驗初重，分別按不同濃度(10、20、40mg/kg/d)的 總 CecropinXJ 和 純 化CecropinXJ(純度達到85%)對小鼠進行灌胃，生理鹽水作對照(CK)，連續(xù)灌胃 7d［31］。

1.2.4 實驗小鼠的觀察和指標(biāo)測定 在連續(xù)灌胃7d里，連續(xù)記錄小鼠的生長狀態(tài)及體重變化;第8d將小鼠處死，解剖取肝臟、胃、脾臟和胰臟，在電子天平上稱重，計算小鼠各臟器系數(shù)［32］。

1.2.5 實驗小鼠病理組織學(xué)切片 選取小鼠的胃和肝，制作石蠟切片，用37%～40%的甲醛固定，經(jīng)脫水－透明－浸蠟－包埋－切片－粘片－脫蠟－染色－膠封等一系列處理后鏡檢，拍照［33］。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CecropinXJ對小鼠一般狀態(tài)的影響

在連續(xù)灌胃的7d里，各組小鼠精神狀態(tài)良好，飲食、飲水正常，被毛光亮，糞便正常，實驗期間死亡率為0。

2.2 CecropinXJ對小鼠體重的影響

通過7d的連續(xù)實驗，在最初1d，體重稍有下降，可能是因為小鼠接觸外來物質(zhì)需要一個適應(yīng)過程。之后幾天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，小鼠體重在CecropinXJ與生理鹽水對照組之間，無顯著性差異(p＞0.05)(圖1)，說明CecropinXJ對小鼠體重增加無明顯抑制作用，對小鼠生長無明顯影響。

圖1 不同濃度CecropinXJ對小鼠體重的影響Fig.1 The influence of mice body weight with different doses of bacterial protein

2.3 CecropinXJ對小鼠臟器系數(shù)的影響

在獲取小鼠內(nèi)臟(肝臟、胃、脾臟和胰臟)后稱量，與小鼠體重計算臟器系數(shù)，進行統(tǒng)計分析后作圖，如圖2。結(jié)果表明:實驗小鼠灌胃總CecropinXJ時(圖2A)，小鼠內(nèi)臟(胃、脾和胰)系數(shù)均在正常范圍內(nèi)，不同處理組間各臟器系數(shù)變化無顯著差異(p＞0.05);實驗小鼠灌胃純化 CecropinXJ時(圖2B)，小鼠胃、脾臟和胰臟系數(shù)在不同處理組間無顯著差異(p＞0.05)，但肝臟系數(shù)與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)，說明高純度高濃度的CecropinXJ對小鼠肝臟系數(shù)有影響。

2.4 病理組織學(xué)觀察

圖2 不同濃度CecropinXJ對小鼠內(nèi)臟系數(shù)的影響Fig.2 The influence of mice organ coefficients with different doses of CecropinXJ

病理組織切片可以在細(xì)胞水平上反映外緣物質(zhì)是否對器官組織造成了損傷。按40mg/kg/d劑量灌胃小鼠，解剖后，取其肝臟和胃做石蠟切片。若CecropinXJ對小鼠有毒性作用或造成小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)，小鼠臟器會出現(xiàn)一些病例變化，如肝臟表現(xiàn)為淤血、狄氏隙顯現(xiàn)、肝細(xì)胞變性、散在性肝細(xì)胞壞死和淋巴細(xì)胞浸潤等，脾臟表現(xiàn)為淋巴濾泡輕度排空和巨噬細(xì)胞增多等。灌胃總CecropinXJ實驗組相較于生理鹽水對照組，肝結(jié)構(gòu)清晰完好，排列有序，肝細(xì)胞未見明顯變性、壞死(圖 4A);灌胃純化的CecropinXJ實驗組(40mg/kg/d)相較于生理鹽水對照組，組織切片結(jié)果顯示肝細(xì)胞排列疏松，有間隙(圖4B);不同CecropinXJ實驗組與對照組相似，胃結(jié)構(gòu)清晰完好，胃粘膜無變形無損傷。灌胃給藥后的胃未見有炎癥反應(yīng)、器官水腫或細(xì)胞壞死等現(xiàn)象，說明CecropinXJ對小鼠胃無明顯損傷(圖3)。

圖3 CecropinXJ灌胃小鼠胃的石蠟切片毒理檢測Fig.3 The toxicity detection of paraffin section of mouse stomach treated by gavage of CecropinXJ

3 結(jié)論與討論

圖4 CecropinXJ灌胃小鼠肝臟的石蠟切片毒理檢測Fig.4 The toxicity detection of paraffin section of mouse liver treated by gavage of CecropinXJ

毒理研究中動物的體重變化是機體各器官、系統(tǒng)發(fā)育狀況的總和，是反映受試毒物對機體毒性作用的一項綜合指標(biāo)，對于判斷受試物毒性作用強度有一定的參考價值［34］。因大多數(shù)雌性動物耐受性強于雄性，且個體之間差異小，故選用雌性小鼠進行實驗。通過7d的連續(xù)實驗，除第一天體重稍有下降外，后續(xù)幾天實驗組小鼠體重相較于對照無明顯變化，可能是因為小鼠初次接觸外來物質(zhì)需要一個適應(yīng)過程。

臟器系數(shù)又稱臟體比，是實驗動物某臟器的重量與其體重之比值。臟器系數(shù)常能反映實驗動物總的營養(yǎng)狀態(tài)和內(nèi)臟的病變情況，臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等;臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。正常狀態(tài)下，臟器系數(shù)比較恒定，當(dāng)接觸外來物質(zhì)致使臟器受到損害，臟器重量發(fā)生改變，臟器系數(shù)將發(fā)生變化［32］。本研究中，灌胃總CecropinXJ實驗組中，小鼠的肝臟、胃、脾臟及胰臟系數(shù)略高于對照組，但與對照組比較均無顯著性差異(p＞0.05);灌胃純化CecropinXJ實驗組中，小鼠的胃、脾臟及胰臟系數(shù)與對照組相比均無顯著性差異(p＞0.05)，但肝臟系數(shù)在灌胃40mg/kg/d實驗組與對照組中存在顯著性差異(p＜0.05)，而其他組無明顯差異(p＞0.05)。因為肝臟作為動物體內(nèi)臟里最大的器官，對機體排毒起重要的作用，灌胃高濃度純化(40mg/kg/d)的CecropinXJ引起肝臟系數(shù)的顯著增加，表明較高純度和濃度的CecropinXJ對肝臟有影響。

石蠟切片(paraffin section)是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織形態(tài)變化的主要方法，且已廣泛地應(yīng)用于其他學(xué)科領(lǐng)域的相關(guān)研究。本研究對灌胃CecropinXJ小鼠的肝臟和胃進行切片毒理檢測，結(jié)果顯示CecropinXJ對小鼠胃沒有顯示出明顯病理變化，而純化的CecropinXJ僅在灌胃40mg/kg/d時，小鼠肝臟顯示出明顯病理變化。說明高純度高濃度的CecropinXJ對小鼠的肝臟有病理上的損傷。

本 實 驗 結(jié) 果 與 Nisin［26－27］、Subticin112［29］及Piscicolin126［35］等的動物實驗結(jié)果基本相符，高純度大劑量的CecropinXJ對小鼠肝臟系數(shù)有一定的影響，對小鼠的肝臟有病理上的損傷。這需要進一步對CecropinXJ的系統(tǒng)毒性(systematical toxicity)進行評估，以確定其整體的毒理作用。

本研究通過檢測CecropinXJ灌胃小鼠的體征指標(biāo)，并對胃和肝臟進行切片病理組織學(xué)檢測，結(jié)果表明，高純度大劑量(40mg/kg/d，純度 85%)CecropinXJ除對實驗小鼠肝臟系數(shù)有影響外，對小鼠的生長生活、體重及其它臟器系數(shù)均無顯著影響;其他劑量CecropinXJ對實驗小鼠臟器系數(shù)無明顯影響。石蠟切片表明總CecropinXJ對小鼠的胃和肝臟均無明顯的毒理性反應(yīng)和病理變化，而高純度大劑量(40mg/kg/d，純度85%)的 CecropinXJ對小鼠肝臟有毒理性反應(yīng)和病理變化。

［1］Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms［J］.Nature，2002，415(6870):389－395.

［2］Cederlund A，Gudmundsson GH，Agerberth B.Antimicrobial peptides important in innate immunity［J］.FEBS Journal，2011，278(20):3942－3951.

［3］Zasloff M.Inducing endogenous antimicrobial peptides to battle infections［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103(24):8913－8914.

［4］Toke O.Antimicrobial peptides:new candidates in the fight against bacterial infections［J］.Peptide Science，2005，80(6):717－735.

［5］Mader JS，Hoskin DW.Cationic antimicrobial peptides as novel cytotoxic agents for cancer treatment［J］.Expert Opinion on Investigational Drugs，2006，15(8):933－946.

［6］Riedl S，Zweytick D，Lohner K.Membrane－active host defense peptides－challenges and perspectives for the development of novel anticancer drugs［J］.Chemistry and Physics of Lipids，2011，164(8):766－781.

［7］Sitaram N，Nagaraj R.Host－defense antimicrobial peptides:importance of structure for activity［J］.Current pharmaceutical design，2002，8(9):727－742.

［8］McDonald M，Mannion M，Pike D，et al.High resolution structures and structure－function relationships in Histidine－rich antimicrobial peptides from cod［J］.Biophysical Journal，2013，104:600.

［9］Nguyen LT，Haney EF，Vogel HJ.The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action［J］.Trends in biotechnology，2011，29(9):464－472.

［10］Arnusch CJ，Pieters RJ，Breukink E.Enhanced membrane pore formation through high－affinity targeted antimicrobial peptides［J］.PloS one，2012，7(6):e39768.

［11］Delves－Brougthon J.Nisin and its uses as a food preservative［J］.Food Technology，1990，44(11):100－117.

［12］Joo NE，Ritchie K，Kamarajan P，et al.Nisin，an apoptogenic bacteriocin and food preservative，attenuates HNSCC tumorigenesis via CHAC1［J］.Cancer medicine，2012，1(3):295－305.

［13］Shi H，Trinh Q，Xu W，et al.The transcriptional response of virulence genes in Listeria monocytogenes during inactivation by nisin［J］.Food Control，2013，31(2):519－524.

［14］Hammami R，F(xiàn)liss I.Current trends in antimicrobial agent research:chemo－ and bioinformatics approaches［J］.Drug discovery today，2010，15(13):540－546.

［15］FjellCD，HissJA，Hancock RE，etal.Designing antimicrobial peptides:form follows function［J］.Nature Reviews Drug Discovery，2011，11(1):37－51.

［16］Torcato IM，Castanho MA，Henriques ST.The application of biophysical techniques to study antimicrobial peptides［J］.Journal of Spectroscopy，2012，27(5－6):541－549.

［17］Hultmark D，Steiner H，Rasmuson T，et al.Insect immunity.Purification and properties of three inducible bac－tericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia［J］.European Journal of Bioche－mistry，1980，106(1):7－16.

［18］Steiner H，Hultmark D，Engstr?m?，et al.Sequence and specificity oftwo antibacterialproteins involved in insect immunity［J］.Nature，1981，292:246－248.

［19］Plunkett RM，Murray SI，Lowenberger CA.Generation and characterization of the antibacterial activity of a novel hybrid antimicrobial peptide comprising functional domains from different insect cecropins［J］.Canadian journal of microbiology，2009，55(5):520－528.

［20］Wu JM，Jan PS，Yu HC，et al.Structure and function of a custom anticancer peptide，CB1a［J］.Peptides，2009，30(5):839－848.

［21］劉忠淵，張富春，趙干，等.新疆家蠶抗茵肽(Cecropin－XJ)在Pichia pastoris中的表達［J］.新疆大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，20(4):418－421.

［22］Xia L，Zhang F，Liu Z，et al.Expression and characterization of cecropinXJ，a bioactive antimicrobial peptide from Bombyx mori(Bombycidae，Lepidoptera)in Escherichia coli［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2013，5(6):1745－1751.

［23］劉忠淵，張富春，蔡倫，等.酵母菌中表達的新疆家蠶抗菌肽(Cecropin－XJ)的特性研究［J］.微生物學(xué)報，2003，43(5):635－640.

［24］Hao YQ，Zhou XD，Xiao XR，et al.Effects of cecropin－XJ on growth and adherence of oral cariogenic bacte－ ria in vitro［J］.Chin－Med－J－(Engl)，2005，118:155－160.

［25］鄭力，李友廣.新疆家蠶抗菌肽在番茄汁加工中的應(yīng)用研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(3):135－139.

［26］Seo M D，Won H S，Kim J H，et al.Antimicrobial peptides for therapeutic applications:a review［J］.Molecules，2012，17(10):12276－12286.

［27］Hara S，Yakazu K，Nakakawaji K，et al.An investigation of toxicity of Nisin with a particular reference to experimental studies of its oral administration and influences on digestive enzymes［J］.Tokyo Med Univ J，1962，20:175－207.

［28］Pesquera T I.Nisin－ its use，estimation and toxicology in sterilized milk［J］.Revita Espanola de Lecheria，1966，59:25.

［29］鄧凱，張日俊.細(xì)菌素 Subticin112對小鼠的急性毒性作用研究［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2011，23(8):1446－1452.

［30］夏麗潔，劉忠淵，許崗，等.家蠶抗菌肽(Cecropin－XJ)的原核優(yōu)化表達及活性檢測［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2012，38(5):0825－0831.

［31］馬廣麗，王莘.鹿茸·鹿花盤蛋白提取物對小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(35):20128－20129.

［32］孫全文，吳淑琴，薛貴平，等.ZGB菌體蛋白對小鼠相關(guān)體征指標(biāo)的影響［J］.實驗動物科學(xué)，2010，27(5):9－12.

［33］王昌河，謝振麗，呂建偉.動物組織石蠟切片HE染色的快速方法［J］.生物學(xué)通報，2012，47(7):50－51.

［34］沈建忠.動物毒理學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002，84－94.

［35］Ingham A，F(xiàn)ord M，Moore R J，et al.The bacteriocin piscicolin 126 retains antilisterial activity in vivo［J］.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2003，51(6):1365－1371.