西施舌多糖對人食管癌EC-9706細胞增殖及抗氧化活性的影響

溫揚敏，楊維群，陳長明，林文東

(泉州醫(yī)學高等專科學校，福建泉州362011)

西施舌(Coelomactra antiquata)福建俗稱“海蚌”，個體較大，肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，是久負盛名的珍品佳肴。從上世紀60年代開始，國內(nèi)學者便開始對西施舌的生物學、人工育苗及人工增養(yǎng)殖進行研究。特別是高如承等［1－2］研究西施舌附著變態(tài)誘導技術(shù)的突破，西施舌人工育苗取得突破性進展。近年來，福建、江蘇、廣東、山東等地西施舌人工育苗養(yǎng)殖取得成功，極大地豐富了西施舌的資源量，為西施舌的食用和藥用開發(fā)利用提供資源。西施舌除食用外，還具有很高的藥用價值。中醫(yī)素以西施舌性寒、味咸，具有滋陰潤燥，利水消腫，化痰軟堅的功效，主治陽虛消渴，水腫，崩漏，帶下，失眠，腰酸，尿少，痰飲，痔瘡，淋巴結(jié)腫大，甲狀腺腫大等癥［3］。食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌發(fā)病率和病死率均居世界之首［4］。多糖(polysaccharide)是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復雜且龐大的糖類物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老等作用［5］。本文研究西施舌多糖對人食管癌細胞增殖及抗氧化活性的影響，旨在為西施舌藥用價值開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西施舌 購自福建福州程普頭市場;人食管癌細胞株EC－9706 購自天呈科技生物公司;DMSO，RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清 購自賽默飛世爾科技公司(北京);胰蛋白酶消化液，細胞裂解液，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 購自碧云天生物公司;注射用環(huán)磷酰胺(CTX) 購自山西普德藥業(yè)公司(國藥準字H14023686);超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化活性(T－AOC)、抑制羥自由基活性和考馬斯亮藍蛋白含量測定試劑盒 均購自南京建成生物研究所。

SP－752紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;KDC－160HR高速冷凍離心機 科大創(chuàng)新公司中佳分公司;FD－1C－50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器公司;KHBST－360型酶標儀 上海科華科技公司;HF－90型CO2培養(yǎng)箱 北京陽光思特生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西施舌多糖(polysaccharides from Coelomactra antiquata，PCA)提取 選擇殼長7～9cm新鮮西施舌成貝，去殼、洗凈、稱取其肌肉50g，剪成約1cm3小塊，放入1000mL燒杯，再加入300mL的雙蒸水，沸水煮30min。冷卻后用定性濾紙過濾，取濾液Sevag法除蛋白。加入乙醇使最終乙醇濃度為80%，過夜沉淀。6000×g離心15min收集多糖，低溫冷凍干燥得到西施舌多糖(PCA)粉末［6］。多糖提取率1.47%，用雙蒸水配置成不同濃度用于實驗。

1.2.2 西施舌多糖對人食管癌EC－9706細胞增殖的影響 采用MTT法［6］測定西施舌多糖對人食管癌EC－9706細胞增殖的抑制作用。人食管癌EC－9706細胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細胞，分于96孔板，調(diào)整細胞濃度約6000個細胞每孔。每孔分別加入含西施舌多糖0(空白對照組)、5、10、20、40mg·mL－1的含 10% 胎牛血清 RPMI－1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，另設一組含 4mg·mL－1環(huán)磷酰胺(CTX)作為陽性對照。細胞分別培養(yǎng)12、24、48h。按MTT試劑盒說明書測定細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率(%)=(1－實驗組吸光度/空白對照組吸光度)×100

1.2.3 西施舌多糖對人食管癌EC－9706細胞抗氧化活性的影響 人食管癌EC－9706細胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細胞，分于6孔細胞培養(yǎng)板，倒置顯微鏡觀察細胞密度約為60%～70%時，每孔分別加入含西施舌多糖0(空白對照組)、5、10、20、40mg·mL－1的含 10%胎牛血清 RPMI－1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)48h后，分別吸取細胞培養(yǎng)板中含不同濃度西施舌多糖的細胞培養(yǎng)上清液2mL，6000×g離心5min，取上清液，按試劑盒說明書測定抑制羥自由基(·OH)能力和總抗氧化(T－AOC)活性。另外，吸去細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)上清液，余下貼壁的食管癌細胞，每孔加入細胞裂解液1mL，37℃裂解細胞 5min，12000 × g離心 5min，取上清液，按試劑盒說明書測定SOD、CAT活性。

1.2.4 西施舌多糖對小鼠原代培養(yǎng)肝細胞抗氧化活性的影響 普通級KM小鼠(福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，斷頭處死，放入75%乙醇浸泡消毒1min后帶入細胞培養(yǎng)室，再放入75%乙醇浸泡消毒1min。解剖小鼠取肝臟，用pH為7.4的PBS沖洗3次，剪碎成約1mm3小塊，加入固液比1∶5的2.5%胰蛋白酶液消化10min，中間搖勻2～3次。用100目網(wǎng)過濾，取濾液1000×g離心5min，棄上清液，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度約1×107mL－1。分別加入含西施舌多糖0(對照組)、5、10、20、40mg·mL－1的含 10%胎牛血清 RPMI－1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)48h后，分別吸取細胞培養(yǎng)板中含不同濃度西施舌多糖的細胞培養(yǎng)上清液2mL，6000×g離心5min，取上清液，測定抑制羥自由基(·OH)活性和總抗氧化(T－AOC)活性。另外，吸去細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)上清液，余下貼壁的小鼠肝細胞，每孔加入細胞裂解液 1mL，37℃裂解細胞5min，12000 ×g離心5min，取上清液，測定 SOD、CAT活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003繪圖及進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西施舌多糖對人食管癌細胞增殖的抑制作用

西施舌多糖對人食管癌Ec－9706細胞體外增殖的影響見圖1，從圖1可以看出細胞培養(yǎng)12h后，所有實驗組與對照組之間細胞增殖抑制率無顯著差異(p＞0.05)。細胞培養(yǎng)24h后，PCA3和PCA4與對照組之間細胞增殖抑制率存在顯著差異(p＜0.05)。細胞培養(yǎng)48h后，除PCA1外，所有實驗組中食管癌細胞的增殖抑制率均大于對照組，與對照組比較，其中PCA3對食管癌細胞的增殖抑制率存在顯著差異(p＜0.05)，PCA4對食管癌細胞的增殖抑制率存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖1 西施舌多糖對人食管癌細胞增殖抑制率的影響Fig.1 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata(PCA)on growth inhibition of esophageal carcinoma cells

2.2 西施舌多糖對食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞CAT活性的影響

CAT存在于紅細胞及某些組織內(nèi)的過氧化物體中，它的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應生成非常有害的·OH，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一［7］。西施舌多糖對食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞CAT活性影響見圖2，從圖2可以看出西施舌多糖能增加食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞的CAT活性，且活性隨西施舌多糖濃度增加而增大。與對照組比較，各實驗組CAT活性均存在極顯著差異(p＜0.01)。此外，在西施舌多糖濃度相同的條件下，小鼠原代培養(yǎng)肝細胞過氧化氫酶活性均高于食管癌細胞，且兩者之間存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖2 西施舌多糖對CAT活性的影響Fig.2 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata on activities of CAT

2.3 西施舌多糖對食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞SOD活性的影響

西施舌多糖對食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞SOD活性的影響見圖3，從圖3可以看出，不同濃度西施舌多糖均能提高食管癌細胞和小鼠肝細胞的SOD活性，且SOD活性隨濃度增大而增加。當西施舌多糖為5mg·mL－1時，食管癌細胞SOD活性與對照組之間存在顯著差異(p＜0.05)，而小鼠原代培養(yǎng)肝細胞與對照組無顯著差異(p＞0.05)。當西施舌多糖濃度為10mg·mL－1及以上時，與對照組比較，食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞SOD活性均存在極顯著差異(p＜0.01)。此外，在西施舌多糖濃度相同的條件下，小鼠原代培養(yǎng)肝細胞的SOD活性均高于食管癌細胞，且兩者之間存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖3 西施舌多糖對SOD活性的影響Fig.3 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata on activities of SOD

2.4 西施舌多糖對細胞培養(yǎng)上清液T－AOC活性的影響

西施舌多糖對食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞培養(yǎng)上清液T－AOC的活性均隨濃度增加而增強(圖4)，且T－AOC活性與西施舌多糖濃度呈線性關(guān)系。在相同濃度西施舌多糖條件下，食管癌細胞培養(yǎng)上清液T－AOC活性均小于小鼠肝細胞，但兩者之間不存在顯著差異(p＞0.05)。當西施舌多糖濃度為5mg·mL－1時，實驗組T－AOC 活性與對照組之間均無顯著差異(p＞0.05)。當西施舌多糖濃度為10mg·mL－1及以上時，與對照組比較，食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞的T－AOC活性均存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖4 西施舌多糖對T－AOC活性的影響Fig.4 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata on activities of T－AOC

2.5 西施舌多糖對細胞培養(yǎng)上清液抑制羥自由基活性的影響

羥自由基(·OH)是已知活性氧中對生物體毒性最強的一種自由基，過多羥自由基能殺死紅細胞，損傷細胞膜，降解DNA等［8］。西施舌多糖對食管癌細胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細胞的培養(yǎng)上清液抑制羥自由基作用隨濃度增加而增強(圖5)。當西施舌多糖濃度為5mg·mL－1時，實驗組抑制羥自由基活性與對照組之間均存在顯著差異(p＜0.05)，而其它實驗組抑制羥自由基活性與對照組之間均存在極顯著差異(p＜0.01)。此外，在西施舌多糖濃度相同的條件下，小鼠肝細胞培養(yǎng)上清液抑制羥自由基活性均高于食管癌細胞培養(yǎng)上清液，且兩者之間存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖5 西施舌多糖對抑制羥自由基活性的影響Fig.5 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata on capability to scavenging hydroxyl radicals

3 討論

海洋貝類含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是新型的創(chuàng)新藥物和功能性食品資源［5］。大量的實驗證實了貝類多糖的抗腫瘤活性，如鮑魚中提取的多糖能抑制鼻咽癌的增殖;從河蚌、瑪瑙螺中提取的多糖對離體肺腺癌細胞、胃癌細胞有較強的抑制作用;菲律賓蛤仔多糖可顯著抑制白血病細胞增殖作用［9－11］。貝類多糖抗腫瘤作用的主要機制與其免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用有關(guān)［9］。腫瘤細胞內(nèi)普遍存在與正常細胞不同的氧化壓力，通常維持較高的氧化狀態(tài)，表現(xiàn)為較高水平的自由基和較低的抗氧化酶活性。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中SOD活性明顯高于癌周邊組織和邊緣正常肺組織［12］。但多數(shù)學者都發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞總的SOD含量低于相應的正常組織。腫瘤細胞內(nèi)SOD含量降低是一種普遍的現(xiàn)象。Westman等［13］發(fā)現(xiàn)不同年齡、性別的不同組織的腫瘤(乳腺癌、腎癌、惡性黑色素瘤、尤文氏肉瘤 淋巴瘤、脂肪肉瘤等)SOD含量明顯低于相應的正常組織。Oberley等［14］研究表明，艾氏腹水瘤的小鼠腫瘤組織的SOD含量顯著低于肝臟。本實驗結(jié)果與以上結(jié)論一致，在西施舌多糖濃度相同的條件下，食管癌細胞SOD和CAT活性均低于小鼠原代培養(yǎng)肝細胞。而有關(guān)抗腫瘤活性物質(zhì)誘導腫瘤細胞抗氧化酶類活性的影響有不同的報道。霍紅梅等［15］研究表明高劑量姜黃素能顯著降低乳腺癌MCF－7細胞的SOD和CAT活性。徐永偉等［16］也發(fā)現(xiàn)紫杉醇能顯著降低犬乳腺腫瘤細胞的SOD和CAT活性。其原因認為降低抗氧化酶活性，會降低腫瘤細胞清除自由基的能力，提高腫瘤細胞自由基含量達到抑制腫瘤效果。但張秀娟等［17］發(fā)現(xiàn)，花青素對S180腫瘤具有顯著抑制效果，卻能提高S180腫瘤的SOD活性。本實驗結(jié)果也表明，不同濃度西施舌多糖均能提高人食管癌細胞SOD和CAT活性，且活性隨濃度增大而增加。其原因可能是提高腫瘤細胞的SOD活性，可使腫瘤細胞部分獲得正常細胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而達到治療腫瘤效果［18］。

自由基學說認為衰老過程中的退行性變化是由于細胞正常代謝過程中產(chǎn)生自由基的有害作用造成的。抗氧化劑和抗氧化酶是人體本身能不斷產(chǎn)生的防御自由基損害的物質(zhì)。有些抗氧化劑可以達到防御疾病、延緩衰老的目的［19］。天然抗氧化劑被人體攝入后，有的作為體內(nèi)抗氧化酶類的誘導劑，能提高體內(nèi)相關(guān)抗氧化酶類水平;有些抗氧化物質(zhì)被人體攝入后能直接消除自由基。有研究表明西施舌提取物能提高正常小鼠的T－OAC、SOD和POD活性，降低MDA含量，提高小鼠的抗氧化能力［20］。本實驗結(jié)果表明，西施舌多糖能提高體外培養(yǎng)細胞抗氧化酶活性和清除羥自由基能力，抑制食管癌細胞增殖。表明西施舌多糖的抗腫瘤效果可能與清除自由基提高機體抗氧化活性有關(guān)，但其抗腫瘤機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

西施舌多糖對人食管癌EC－9706細胞具有體外增殖抑制的作用，其抑制效果具有明顯的濃度依賴性，并隨時間延長抑制作用越明顯。西施舌多糖能提高體外培養(yǎng)細胞抗氧化酶活性和抑制羥自由基活性。在西施舌多糖濃度相同條件下，小鼠原代培養(yǎng)肝細胞SOD、CAT活性均高于食管癌細胞，小鼠原代培養(yǎng)肝細胞培養(yǎng)上清液總抗氧化和抑制羥自由基活性也高于食管癌細胞。

［1］高如承，劉文彪.幾種化學物質(zhì)對西施舌幼蟲附著和變態(tài)的誘導技術(shù)［J］.水產(chǎn)學報，2006，30(5):588－60.

［2］劉文彪，高如承，黃振彬，等.L－DOPA對西施舌眼點幼蟲附著變態(tài)誘導的研究［J］.海洋科學，2006，30(2):26－29.

［3］孟學平，高如承，董志國，等.西施舌營養(yǎng)成分分析與評價［J］.海洋科學，2007，31(1):16－20.

［4］祁敏，魏顯招，吳愛群.食管癌的表觀遺傳學與防治研究進展［J］.醫(yī)學研究雜志，2009，38(11):21－23.

［5］湛孝東，王克霞，李朝品.貝類多糖生物學活性研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(7):1285－1286.

［6］Hong Ye，Keqi Wang，Chunhong Zhou，et al.Purification，antitumor and antioxidant activities in vitro of polysaccharidesfrom the brown seaweed Sargassum pallidum［J］.Food chemistry，2008，111(2):428－432.

［7］張坤生，田蕓琳.過氧化氫酶的功能及研究［J］.食品科技，2007，32(1):8－10.

［8］朱本占.一種新型羥基自由基產(chǎn)生分子機理的研究［J］.科學通報，2009，5(12):1673－1670.

［9］朱濤，李朝品.貝類多糖抗腫瘤作用的研究進展［J］.中國醫(yī)藥前沿，2009，4(4):24－26.

［10］王兵，蔣建敏，許東暉，等.鮑魚多糖對荷人鼻咽癌裸鼠抗癌作用的研究［J］.中草藥，2000，31(8):597.

［11］崔悅禮，趙翠蘭，李開源，等.三種貝類多糖 MPa、MPc和MPf藥理作用的初步研究［J］.云南大學學報:自然科學版，1998，20(3):172.

［12］江朝光，忱文梅，黃孝逼，等.人肺癌組織中錳超氧化物歧化酶活力的研究［J］.中華腫瘤雜志，1990，12(5):348－350

［13］Westman NG，Marklund SL.Copper－and zinc－containing superoxide dismutase and manganese－containing superoxide dismutase in human tissues and human malignant tumors［J］.Cancer research，1981，41(7):2962－2965.

［14］Oberley LW，Buettner GR.Role of superoxide dismutase in cancer:a review［J］.Cancer research，1979，10(39):1141.

［15］霍紅梅，張利元，江家貴.姜黃素抑制乳腺癌MCF－7細胞增殖及其相關(guān)的氧化應激機制［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16(5):490－493.

［16］徐永偉，李華濤，李響，等.紫杉醇誘導犬乳腺腫瘤細胞凋亡和細胞ROS及SOD失衡的研究［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2011，33(8):606－610.

［17］張秀娟，王聰，季宇彬.松樹皮中原花青素對荷瘤小鼠S180腫瘤細胞抗氧化酶系的影響［J］.齊魯藥事，2010，29(12):705－707.

［18］喻倫銀，劉漢橋，田鴻生.超氧化物歧化酶與腫瘤關(guān)系的研究進展［J］.實用癌癥雜志，1992，7(3):229－231.

［19］Peter Storz.Reactive oxygen species in tumor progression［J］.Front Biosci，2005，10(1):1881－1894.

［20］溫揚敏，羅彩林，陳淑增，等.西施舌提取物對正常小鼠體內(nèi)抗氧化功能的影響［J］.食品工業(yè)科技，2011，241(5):371－372.