大豆蛋白過敏原結構與功能的研究進展

朱婷偉，陳復生，布冠好，孫 倩，劉昆侖

(河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001)

大豆是我國種植面積最廣、食用最多而又廉價的植物蛋白資源，在食品工業中廣泛使用［1］。但同時大豆是8類主要致敏食物之一。大豆蛋白是存在于大豆種子中許多蛋白質的總稱，成分按沉降系數不同分為2S組分8%～22%、7S組分35%、11S組分31%～52%、15S組分5%及存在的少量其他成分。其中，7S組分中約85%是β－伴大豆球蛋白;11S組分中約85%是大豆球蛋白［2］。大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白是大豆中蛋白質的主要構成成分，二者約占到70%。大豆過敏可引發過敏體質人群產生Ⅰ型過敏反應，目前在線過敏原數據庫中收錄有41條大豆過敏原信息［3］。多項研究證實，大豆蛋白過敏原會引起嬰幼兒、仔豬、犢牛、大鼠等幼齡動物的過敏反應［4］。約1%～6%的嬰幼兒對大豆過敏，隨著對大豆及大豆產品使用量的增加，成年人對大豆過敏的發生率也在日趨上升［5］。大豆過敏可引起胃腸道紊亂，皮炎性過敏，惡心、嘔吐，嚴重時還可導致休克和死亡［6］。近些年，有學者就主要過敏原的抗原表位，過敏原改性方法及檢測方法進行了一定研究，但對大豆過敏原的抗原表位、結構特性及過敏原的種類等研究還不夠完善。本文將對大豆蛋白主要過敏原的相關研究進展進行總結，為大豆蛋白過敏原結構、抗原表位的完善及低敏性大豆蛋白制品的開發提供重要的理論依據。

1 大豆蛋白過敏原的結構與功能

大豆抗原是大豆中的主要抗營養因子之一，是能引起過敏反應的一類蛋白質，亦稱大豆過敏原。Franck［7］研究發現，不同的大豆產品中蛋白質含量和抗原分布不同。大豆中發現有致敏性的蛋白如表1所示。其中7S球蛋白組分中的Gly m Bd 28K和Gly m Bd 30K和β－伴大豆球蛋白的α亞基Gly m Bd 60K是大豆中的主要致敏原［8］。

1.1 Gly m Bd 30K

Gly m Bd 30K與P34的氨基酸組成和N端氨基酸序列一致，故又名P34。它是由257個氨基酸殘基組成的不溶于水的單分子糖蛋白，分子量約為34ku，等電點為5.79［15］。該蛋白能與β－伴大豆球蛋白的亞基通過二硫鍵結合來參與大豆蛋白的折疊。單曉紅［15］等對Gly m Bd 30K二級結構預測的結果顯示:α－螺旋占 29.29%，β－轉角占 5.28%，β－折疊占19.53%，無規則卷曲為45.91%。除部分α－螺旋和β－轉角在蛋白質的外側，絕大部分β－折疊在蛋白質的中間區域。P34與木瓜蛋白酶家族的三級構象是一致的，屬于木瓜蛋白酶超家族。圖1為預測的P34的三級結構示意圖［15］。

30K主要存在于種子的子葉里，能與油體結合在一起。P34可能是植物對抗假單胞菌的一種防御蛋白，其生物學功能通過結合細菌分泌的丁香交酯而起防御的作用;有研究顯示P34的變種大豆還可作為調節丁香交酯分泌的信號感受器［16］。

1.2 Gly m Bd 60K

β－伴大豆球蛋白包含α亞基、α'亞基和β亞基三個亞基，分子質量分別約為68、71和50ku，它們以同源或異源的三聚體形式存在［17］。其中Gly m Bd 60K是由多糖與蛋白質N端的天門冬氨酸結合而成，等電點為4.9。袁德保［18］等利用遠紫外圓二色光譜對純化得到的β－伴大豆球蛋白二級結構進行了表征，其中α亞基的二級結構中，α－螺旋占9.8%，β－折疊占32.1%，β－轉角占22.8%，無規則卷曲占35.4%。其模擬的三級結構示意圖如圖2所示［19］。

表1 大豆中抗原蛋白及其相關性質［9］Table 1 Allergen proteins in soybean and their relative characteristics［9］

圖1 預測的P34三級結構示意圖Fig.1 Predicted tertiary structure of P34

圖2 Gly m Bd 60K的三維結構示意圖Fig.2 Three－dimensional structure of Gly m Bd 60K

60K具有較好的熱穩定性［20］。左偉勇提到有人從α亞基中提取到的soymetide－4能夠刺激人的多核白細胞的吞噬作用，且在動物實驗中能夠抑制服用抗癌藥所引起的禿毛癥;更有研究表明伴大豆球蛋白能刺激肝臟中的低密度脂蛋白受體，降低膽固醇的含量［21］。

1.3 Gly m Bd 28K

Gly m Bd 28K是一種類蠶豆球蛋白，屬于Cupin超家族。它是大豆7S組分中的另一種重要的過敏原，包含了220個氨基酸殘基，分子質量約為26ku，等電點為6.1［22］。28K的多糖分支鏈為β－1→2木糖和α－1→3巖藻糖，在植物體內以寡聚體形式存在，推測的糖骨架為Man3GIcNAc［23］2，結構為普通的β－桶形。28K的前體為C－末端的23ku肽，N266殘基的羧基側裂解發生28K與前體的轉換，且在28K中內切酶可能與天冬氨酰肽鏈內切酶功能類似，參與到植物蛋白的代謝過程中［24］。

2 大豆蛋白的過敏原表位

引起人過敏的過敏原大多數是食物中的蛋白質，實質上，與過敏反應相關的是蛋白質中部分抗原決定簇，又稱為表位［25］。Burks［26］的免疫印跡實驗發現大豆過敏患者的血清中存在對7S球蛋白有特異性的IgE抗體和對11S有特異性的IgG抗體。Ogawa等［9］利用人體血清中IgE抗體與致敏原相結合的特性，通過檢測69位過敏患者血清檢索出大豆蛋白質多種成分的抗原性，發現Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K和Gly m Bd 60K是大豆中的三種主要致敏原。之后，有人對這3種主要的大豆過敏原結合表位等相關信息做了報道。

2.1 Gly m Bd 30K

Ogawa研究發現［8］Gly m Bd 30K 能被65%的大豆敏感個體血清所識別產生過敏癥狀，被認為是致敏性最強的儲藏蛋白。在1996年Bando［27］對30K的糖基化位點進行了研究，通過測定其氨基酸序列確定了抗體結合部位。30K的氨基酸順序如圖3所示［15］。經氨基酸序列分析糖蛋白的結合位點位于多肽鏈170位天冬酞胺處。其多糖部分包括甘露糖，N－乙酞氨基葡萄糖，巖藻糖，木糖四種糖分子，其比例為 3∶2∶1∶1［23］。Hosoyama［28］等發現 30K 的 2 個重要抗原表位區F5和H6。抗原表位分析成熟的30K蛋白至少有14個抗原表位，在30K的70位和170位的氨基酸存在兩個潛在的糖基化位點。P34的活性部位中的第38位半胱氨酸上擁有一個甘氨酸取代基，缺乏其家族中其他蛋白酶的半胱氨酸酶活性接觸位點。緊接著Helm等［29］研究發現了30K蛋白上其中5個主要的抗原表位分別被定于3～12、100～110、229～238、299～308 和 331～340 位的氨基酸殘基上，且不同的IgE抗原表位結合能力的差異顯著性因不同過敏病人血清而異。林蘇霞［30］等成功構建的Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位區單體為制備用于大豆主要過敏原檢測的試劑奠定了基礎。

圖3 Gly m Bd 30K氨基酸順序示意圖Fig.3 Amino acid sequence schematic of Gly m Bd 30K

2.2 Gly m Bd 60K

60K的mRNA帶有poly(A)尾，且在N－端含有一個22個氨基酸的信號肽，去除信號肽后的前體肽為583個氨基酸，而成熟的60K由543個氨基酸形成［31］。Gly m Bd 60K 的氨基酸順序如圖 4 所示［32］。其IgE抗原表位位于不含糖基化位點的N－端232－383 殘基處［31］。Ogawa［14］等研究只證明了 α 亞基能被25%的大豆過敏患者的血清所識別，是β－伴大豆球蛋白組分中的一個過敏原。直到2009年，Krishnan［33］等研究發現 Gly m Bd 60K 能與大豆敏感個體血清中IgE特異性結合而引起大豆過敏癥狀。

2.3 Gly m Bd 28K

Tsuji等［22］以單克隆抗體作為配體，用免疫親和柱層析法分離純化大豆主要過敏原中Gly m Bd 28K。28K的糖基化位點可能是IgE抗體識別的重要的表位，由473個氨基酸的多肽組成。Dolly［34］研究表明28K的N－末端與NBS－LRR型抗病花生蛋白有同源性，12個殘基序列為GRREDDYDNLQL;推導出的氨基酸序列與MP27/MP32具有高度的同源性，與南瓜蛋白中的存儲空泡蛋白有50.4%的同一性，與胡蘿卜蛋白之間有45.9%的同一性。Gly m Bd28K的致敏性為N－連接糖部分，并與大多過敏患者血清中的IgE抗體結合，其氨基酸順序如圖5所示［24］。有研究［35］發現在距28K多肽分子C端23ku處一個非常重要的IgE結合區域，這對大豆過敏原的研究具有重要意義。Hiemori等［36］發現，大豆過敏患者血清中IgE抗體識別位點為肽骨架第20位天冬酞胺連接的N－連接聚糖，此過敏原能引起約25%的大豆敏感個體產生過敏癥。Xiang［34］等研究發現，該過敏原肽鏈C端區域結合IgE的能力比N端區域更強，其抗原表位主要的線性C－末端抗原表面位于S256和A270之間，并定位了 Y260，D261，D262，K264 和 D266 這5個主要IgE結合的氨基酸殘基。

圖5 Gly m Bd 28K氨基酸順序示意圖Fig.5 Amino acid sequence schematic of Gly m Bd 28K

3 結論

隨著對Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K和Gly m Bd 60K三大主要大豆過敏原的普遍認可，以及近年來食物過敏的嚴重性和發生頻率的不斷上升，食品過敏問題必須重視。30、60、28K是目前發現的三種主要大豆蛋白過敏原，這些過敏原分子上分布著很多過敏原表位，IgE結合實驗也證實了許多表位的存在。已有應用于大豆過敏原檢測的方法的研究，但還沒有形成靈敏度高、快速且成本低的檢測方法，且關于這三種過敏原結構功能、抗原表位區域及致敏機理等的研究還不夠成熟，而這些相關生化特性的探究是建立大豆過敏原檢測及降低的重要理論依據。文章中僅總結了部分過敏原功能及表位的研究。更多的相關研究以及大豆蛋白中存在的其他過敏原也尚需探究。為了精確定位大豆主要過敏原表位，今后需進一步研究構成表位的必需氨基酸殘基、大豆抗原蛋白的完整組成，深入了解復雜的過敏反應，揭示重要抗原蛋白的致敏機理，同時優化和改進大豆抗原檢測方法同樣具有潛在的需要。這些將為大豆蛋白過敏原掩蔽方法、改性大豆蛋白、開發低敏性大豆蛋白制品提供重要的理論依據。

［1］江連洲，胡少新，李楊，等.大豆加工領域的科學技術問題［J］.中國食品學報，2011，11(9):98.

［2］劉賓.大豆主要過敏原的免疫檢測研究［D］.北京:中國農業科學院，2011，2－5.

［3］鄭文杰，陳穎，曹際娟.食品中過敏原及其成分檢測［M］.北京:中國標準出版社，2010:42－44.

［4］韓鵬飛，姜學，馬曦.大豆抗原蛋白研究進展［J］.中國畜牧雜志，2009，45(19):69－72.

［5］Shannon W，Kristen B，Elvira G.Allergenic Proteins in Soybean:Processing and Reduction of P34 Allergenicity［J］.Nutrition Reviews，2005，63(2):47－48.

［6］方旭前，朱友林，邱麗娟.大豆過敏原與低過敏原種質創新［J］.遺傳，2006，28(8):1043－1050.

［7］Franck P，Vautrin MD，Dousset B，et al.The allergenicity of soybean－ based products is modified by food technologies［J］.International Archives of Allergy and Immunology，2002，128(3):212－219.

［8］Ogawa T，Samoto M，Takahashi K.Soybean allergens and hypoallergenic soybean products［J］.Nutritional Science and Vitaminology，2000，46(6):271－279.

［9］Ogawa T，Bando N，Tsuji H，et al.Investigations of the IgE－bingding proteins in soybeans by immunoblotting with sera from soybean－sensitive patients with atopic dermatitis［J］.Nutritional Science and Vitaminology，1991，37(6):555－565.

［10］Rodrigo MJ，Morell F，Helm RM，et al.Identification and partial characterization of the soybean－dust allergen involved in the Barcelona asthma epidemic［J］.Allergyand Clinical Immunology，1990，85(4):778－784.

［11］Julka S，Kuppannan K，Karnoup A，et al.Quantification of Gly m 4 protein，a major soybean allergen，by two－dimensional liquid chromatography with ultraviolet and mass spectrometry detection［J］.Analytical Chemistry，2012，84(22)，10019－10030.

［12］Hemrna EM，Melroy DL，Buckhout TJ.Apparent processing of a soybean oil body protein accompanies the onset of oil mobilization［J］.Plant Physiology，1990，94(1):341－349.

［13］Kalinski A，Weisemann JM，Matthews BF，et al.Molecular cloning of a protein associated with soyben seed oil bodies that is similar to thiol proteases of the papain family［J］.Biological Chemistry，1990，265(23):13843－13848.

［14］Liu B，Teng A，Yang Y，et al.Development of a competitive ELISA for the detection of soybean α subunit of β － conglycinin［J］.process biochemistry，2012，47(2):280－287.

［15］單曉紅，孫秀蘭，管露，等.大豆主要過敏原Gly m Bd 30K抗原決定簇表征預測研究［J］.分析科學學報，2012，28(6):771－773.

［16］Ji C，Boyd C，Slaymaker D，et al.Characterization of a 34－kDa soybean binding protein for the syringolide elicitors［J］.Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，1998，95(6):3306－3311.

［17］Hei WJ，Li Z，Ma X，et al.Determination of beta－conglycinin in soybean and soybean products using a sandwich enzyme－linked immunosorbent assay［J］.Analytica Chimica Acta，2012，734(13):62－68.

［18］袁德保，楊曉泉，黃科禮.伴大豆球蛋白亞基色譜分離和制備及結構表征［J］.分析化學研究簡報，2010，38(6):877－880.

［19］ Fu CJ，Jez JM，Kerley MS，etal.Identification，characterization，epitope mapping，and three－ di－ mensional modeling of the alpha－subunit of beta－conglycinin of soybean，a potential allergen for young pigs［J］.Agricultural and Food Chemistry，2007，55(10):4014－4020.

［20］黃科禮，袁德保，鄭恒光，等.大豆伴球蛋白組成亞基組成亞基熱穩定性及其相關影響因素分析［J］.食品工業科技，2011，32(6):169－172.

［21］左偉勇.伴大豆球蛋白促雙歧桿菌增殖膚的分離和鑒定及其對腸道細菌區系的影響［D］.南京:南京農業大學，2005，10－81.

［22］Tsuji H，Bando N，Hiemori M，et al.Purification and characterization of soybean allergen:Gly m Bd 28K［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1997，61(6):942－947.

［23］Liu B，Teng D，Wang X M，et al.Detection of the soybean allergenic protein Gly m Bd 28K by an indirect enzyme－linked immunosorbent assay［J］.Agricultural and Food Chemistry，2013，61(4):822－828.

［24］Hiemori M，Ito H，Kimoto M，et al.Identification of the 23－kDa peptide derived from the precursor of Gly m Bd 28K，a major soybean allergen，as a new allergen［J］.Biochimicaet Biophysica Acta，2004，1675(1－3):174－183.

［25］劉曉毅.大豆食源性致敏蛋白的識別、去除及脫敏后加工特性研究［D］.北京:中國農業大學，2005，8－10.

［26］Burks AW，Brooks JR，Sampson HA.Allergenicity of major component proteins of soybean determined by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)and immunoblotting in children with atopic dermatitis and positive soy challenges［J］.Allergy and Clinical Immunology，1988，81(6):1135－1142.

［27］Bando N，Tsuji H，Yamanishi R，et al.Identification of the glycosylation site of a major soybean allergen，Gly m Bd 30K［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1996，60(2):347－348.

［28］Hosoyama H，Obata A，Bando N，et al.Epitope analysis of soybean major allergen Gly m Bd 30K recognized by the mouse monoclonal antibody using overlapping peptides［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1996，60(7):1181－1182.

［29］Helm RM，Cockrell G，Herman E.Celluar and molecular characterization of a major soybean allergen［J］.International Archives of Allergy and Immunology，1998，117(1):29－37.

［30］林蘇霞，王曉梅，劉志剛，等.大豆主要過敏原Gly m Bd 30K的抗原表位區基因的克隆表達、純化及免疫原性鑒定［J］.大豆科學，2010，29(2):187－189.

［31］劉賓，滕達，王建華.大豆主要致敏蛋白生化特性的研究進展［J］.中國飼料，2010(20):12－16.

［32］Zheng SG，Tian H，Ma N，et al.Purification and IgE－binding properties of soybean β － conglycinin subunits［J］.Process Biochemistry，2012，47(12):2531－2537.

［33］Krishnan HB，Kim WS，Jang S，et al.All three subunits of soybean β － conglycinin are potential food Allergens［J］.Agriculturial and Food Chemistry，2009，57(3):938－943.

［34］Dolly K，Naveen A，Ramkrashan K，et al.Isolation and characterization of a 28 kDa major allergen from blackgram(Phaseolus mungo)［J］.Immunobiology，2012，217(9):895－904.

［35］Tsuji H，Hiemori M，Kimoto M，et al.Cloning of cDNA encoding a soybean allergen，Gly m Bd 28K［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2001，1518(1－2):178－182.

［36］Hiemori M，Bando N，Ogawa T，et al.Occurrence of IgE antibody－recognizing N－linked glycan moiety of a soybean allergen，Gly m Bd 28K［J］.International Archives of Allergy and Immunology，2000，122:238－245.