植物乳桿菌ST－ⅢproU基因簇的克隆、表達

趙山山，張秋香，劉小鳴，郝光飛，趙建新，陳永泉，張 灝，陳 衛

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

乳桿菌長期以來被用于食品發酵工業中，乳桿菌屬包括超過50個不同的種，是乳酸菌中最大的屬之一［1－2］。在發酵過程，如發酵干酪［3］、香腸［4］、魚［5］、醬油［6］、蔬菜［7］以及食品保藏中乳桿菌經常會遇到高鹽環境，高鹽濃度引起的高滲透壓會導致細胞在結構和生理上的損傷［8－9］，因此乳桿菌在高滲環境中存活、生長、代謝的能力對于工業生產至關重要。分離自泡菜中的商業化菌株植物乳桿菌 ST－Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST－Ⅲ)［10］，具有很強的耐鹽能力，甚至可以在含鹽量高達8%的環境中生長。通過對植物乳桿菌ST－Ⅲ的全基因組測序和基因注釋發現植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因組中存在多個與相容性溶質轉運體［11］，在其獨有的質粒上發現了基因簇proU［12］，proU 含有 3 個開放閱讀框，分別為 proX(LPST_P0028)、proW(LPST_P0029)及 proV(LPST_P0030)。Kanstantsin等人［13］發現大腸桿菌的基因簇proU編碼的蛋白通過向細胞內轉運甘氨酸甜菜堿、脯氨酸甜菜堿來應對外界滲透壓的升高。由此推測，植物乳桿菌ST－Ⅲ所具有的較為突出的耐鹽能力可能與其特有的質粒上的基因簇proU及其包含的3個基因有關。

乳酸乳球菌乳脂亞種比乳酸亞種對滲透壓力更敏感［14］，乳酸亞種可以在鹽濃度為4%(w/v)的環境下生長，而多數乳酸乳球菌乳脂亞種只能在鹽濃度為2%及以下的環境中生長。為了研究基因簇proU在植物乳桿菌ST－Ⅲ耐鹽中的作用，將其整個基因簇及其包含單個基因分別克隆到了耐鹽能力較低的乳酸乳球菌NZ9000(Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000)中，對基因簇proU進行功能驗證。研究與乳桿菌耐鹽能力相關的基因，為挖掘其益生功能奠定了基礎，對乳桿菌的工業應用具有重要的意義。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ST－Ⅲ、乳酸乳球菌NZ9000及載體pNZ8148 本實驗室保存;KOD plus高保真DNA聚合酶、dNTP Takara公司產品;T4 DNA連接酶和限制性內切酶NcoI、BspHI、SacI NEB公司產品;甜菜堿、Nisin Sigma公司產品;氯霉素 上海生物工程有限公司產品;Trizol試劑 Invitrogen公司產品;細菌基因組DNA提取試劑盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0)、反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent kit)Takara公司產品;質粒小提取試劑盒 Solarbio公司產品;熒光定量PCR(RT－PCR)試劑盒(Power SYBR Green PCR Master Mix)Applied Biosystems公司產品。

Electropotator 2510型電轉化儀、1mm電擊轉化杯 Eppendorf公司;ABI－Prism 7300sequence detection system型熒光定量PCR儀 Applied Biosystems公司;UV－2450型分光光度儀 Shimadzu公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基及生長條件 植物乳桿菌ST－Ⅲ于MRS培養基中，37℃靜置培養 12h;乳酸乳球菌NZ9000于GM17培養基(M17培養基，0.5%葡萄糖)中，30℃靜置培養12h。耐鹽實驗中重組菌株在化學成分確定培養基(CDM)［15］中30℃靜置培養22.5h。

1.2.2 基因進化分析 通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)軟件將 proX(GI:308183779)、proW(GI:308183780)、proV(GI:308183781)序列與GenBank中的序列進行比對，并選取相似性較高的序列用ClustalX V2.0進行分析，用MEGA3.1進行核酸序列同源性分析，NJ法(neighbor joining)構建系統發育樹。

1.2.3 質粒的構建 根據目的基因proX、proW、proV及proU的序列設計引物(表1)，以植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因組DNA為模板擴增得到基因proX、proW和proV，基因的大小分別約為 918、804、1200bp，純化擴增產物。質粒pNZ8148與proX、proW分別用NcoI和SacI進行雙酶切，proU，proV用BspHI和SacI進行雙酶切，酶切產物進行膠回收后在16℃下過夜進行連接反應。連接產物轉化至乳酸乳球菌NZ9000，電擊條件為電容25μF，電阻200Ω，電壓2000V，電機時間2.5～3.0ms。轉化菌液涂布于含有氯霉素的GM17平板，30℃過夜培養。隨機挑取選轉化子，提取質粒DNA為模板擴增目的基因進行驗證。擴增產物經過純化后，送至上海生物工程有限公司進行測序。

1.2.4 重組菌的誘導表達及驗證 挑取測序正確的轉化子接種到氯霉素終濃為10μg/mL的GM17液體培養基中，30°C靜置培養過夜。按照2%(v/v)接種量轉接于含有氯霉素的GM17培養基中，當OD600達到0.5～0.6時，以終濃度為10ng/mL的nisin在30℃誘導6h后［16］，5000r/min離心5min收集菌體。液氮研磨菌體后用Trizol試劑提取總RNA，反轉錄獲得cDNA后，分別以proX、proW、proV和16S rDNA基因設計的RT－PCR引物(表1)進行擴增。反應體系為20μL:SYBR Green PCR 混合液 10μL，正、反向引物各0.5μL，cDNA 或無菌水(陰性對照)1μL，無菌水8μL。RT－PCR 程序為 50℃ 2min，95℃ 10min，進行40個循環后95℃ 15s，60℃ 30s。選擇16S rDNA基因為內參，實驗進行3個生物學重復，每個基因分別做3個平行。

1.2.5 重組菌株耐鹽能力的測定 重組菌株在10μg/mL氯霉素的CDM液體培養基中，30℃靜置培養。經nisin誘導表達后以2%的接種量分別接入新鮮的含有3%NaCl(w/v)及10ng/mL nisin的CDM培養基，CDM中添加終濃度為1mmol/L的甜菜堿，同時以不添加甜菜堿的為對照。每2.5h測定菌液的吸光值，繪制生長曲線。

2 結果與討論

2.1 基因進化分析

根據NJ發構建的系統發育樹結果見圖1。植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因簇proU包含的3個基因proX、proW、proV均與戊糖乳桿菌 IG1(Lactobacillus peutosus IG1)相似性最高，達到100%。Ricciardi等人研究［17］發現戊糖乳桿菌有較高的耐鹽能力，鑒于植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因簇proU包含的這3個基因與戊糖乳桿菌IG1的對應基因發育地位相近，由此推測植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因簇proU及其包含的3個基因proX、proW、proV可能是與其耐鹽能力相關的基因。

圖1 基于目的序列proX、proW、proV的系統進化樹Fig.1 Neighbour joining phylogenetic tree showing the phylogenetic position of proX，proW，proV

2.2 質粒的構建

將PCR擴增得到的基因proX、proW、proV及proU分別克隆至質粒pNZ8148中的多克隆位點上，構建得到4個重組質粒:pNZ8148－proX、pNZ8148－proW、pNZ8148－proV及pNZ8148－proU。電擊轉化法將重組質粒轉化到乳酸乳球菌NZ9000中，在含有氯霉素的GM17抗性平板上隨機挑選轉化子單克隆菌落，抽提質粒DNA并進行PCR鑒定(圖2)。擴增得到的proU基因大小約為3022bp，proX、proW和 proV基因的大小分別約為918、804、1200bp，均與基因實際大小相符合。進一步將轉化子進行測序，結果符合預期(結果未列出)，表明乳酸乳球菌重組表達質粒pNZ8148－proX、pNZ8148－proW、pNZ8148－proV 及pNZ8148－proU構建成功。

圖2 重組質粒PCR驗證Fig.2 PCR identification of recombination plasmids

2.3 RT－PCR 分析

為了驗證插入基因是否在重組菌中表達，以插入空質粒的乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)為對照菌株，利用RT－PCR技術檢測proX、proW、proV在乳酸乳球菌中的表達量。如圖3所示，基因proX、proW、proV在乳酸乳球菌中經nisin誘導后的表達量與對照菌株相比分別提高了197、106、170倍。而將整個proU基因簇克隆表達到乳酸菌球菌NZ9000中，表達量與對照菌株的表達量相比提高了113倍。由此說明，經過nisin誘導，基因proX、proW、proV及proU在乳酸乳球菌中成功表達。

2.4 重組菌株耐鹽生長曲線

為驗證基因簇proU在耐鹽中的作用，在鹽濃度為3%的CDM中測定重組菌株的生長曲線。由圖4可以看出:原始菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)無論在是否含有甜菜堿的CDM中均不生長;在不含有甜菜堿的CDM中培養的重組菌株的生長量遠遠低于在含有甜菜堿的CDM中培養的重組菌株;在甜菜堿存在下培養的重組菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148－proU)、乳酸乳球菌 NZ9000(pNZ8148－proX)、乳酸乳球菌 NZ9000(pNZ8148－proW)、乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148－proV)它們的耐鹽能力均比乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)的耐鹽能力強。由此可見，誘導表達與甜菜堿轉運相關的基因簇proU及其包含的基因，均提高了重組菌株的耐鹽能力，使原本不能在鹽濃度為3%的CDM培養基中生長的乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)可以在3%鹽濃度下生長，并且重組菌株通過轉運甜菜堿提高了菌株的耐鹽能力。

圖3 qRT－PCR分析重組菌株誘導后proX、proW、proV、proU基因的相對表達量Fig.3 qRT－PCR analysis of proX、proW、proV、proU genes transcription

圖4 重組菌株耐鹽生長曲線。Fig.4 Growth curve of recombinant strain in CDM with salt

3 結論

插入基因簇proU及其包含的3個基因proX，proW，proV的重組菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148－proU)、NZ9000(pNZ8148－proX)、NZ9000(pNZ8148－proW)及NZ9000(pNZ8148－proV)的耐鹽能力均優于對照菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)，均能夠在含有甜菜堿的鹽濃度為3%的環境下生長;且插入完整基因簇proU的重組菌株耐鹽能力最強，說明整個基因簇包含的3個基因同時存在時更有利于提高對乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)的耐鹽能力。插入基因proW和proV的重組菌株耐鹽能力次之，插入基因proX的重組菌株耐鹽能力最弱，但均優于對照菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)，說明插入基因簇proU包含的單個基因也可提高乳酸乳球菌NZ9000的耐鹽能力。綜上所述，本研究結果表明來源于植物乳桿菌ST－Ⅲ特有質粒上的基因簇proU及其包含的3個基因是與耐鹽相關的基因。

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