白癜風維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及其與免疫異常的關系

韋海鵬 鐘永軍 李曉華

1.北海市人民醫(yī)院皮膚科,廣西北海 536000;2.右江民族醫(yī)學院微免教研室,廣西百色 533000

臨床上,白癜風是一種以局部色素脫失形成白斑為特征的常見多發(fā)性色素性皮膚病,是一種獲得性疾病,臨床主要表現為皮膚色素脫失進而形成的白色的點或者斑片,大小從幾毫米到數厘米不等,其周圍為正常皮膚,隨著病情的發(fā)展,色素脫失癥狀會逐漸擴大,形成更大的皮損[1-2]。遺傳和流行病學研究發(fā)現[3],白癜風患者可能有一定的遺傳缺陷傾向,使黑素細胞容易被破壞,最終引起白癜風的發(fā)生。維生素D受體基因定位于12號染色體長臂1區(qū)3帶上,存在多個限制性內切酶酶切位點。研究已證實[4],維生素D受體基因與皮膚黑素細胞的數量變化有一定的關系。在此背景下,本研究即探討白癜風維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及其與免疫異常的關系,為其臨床研究提供可參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續(xù)收集2011年12月—2013年1月該院皮膚科門診的白癜風患者94例作為病例組,按照中華醫(yī)學會白癜風診斷標準進行診斷,其中男性53例,女性41例,年齡8～63歲,平均年齡(28.6±8.2)歲。同時隨機選取無血緣關系的健康人群98例作為對照組,其中男性55例,女性43例,年齡8～67歲,平均年齡(28.7±8.1)歲。兩組間性別、年齡等基本資料比較差異不明顯(P＞0.05),具有臨床可比性。所有受試者均排除外傷、血液系統(tǒng)疾病、急性感染、惡性腫瘤等疾病;既往有肝腎功能不全等。納入對象均不存在血緣關系,且均簽署了知情同意書,符合醫(yī)院相關管理條例。

1.2 方法

入院后對所有受試者的基本信息及相關病史進行詳細的調查,病例組患者于入院后次日晨、對照組于參與本課題當日同一條件下抽取所有受試者的血液樣本4 mL,其中2 mL應用檢測外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG等相關生化指標,另外2 mL用于提取白細胞基因組DNA。

采用PCR-RFLP技術檢測和DNA測序技術驗證維生素D受體Apa I基因多態(tài)性,所用引物均應用軟件Premier5.0自行設計,上游引物:5‘-CAACC AAGAC TACAA GTACC GCGTC AGTGA-3‘;下游引物:5‘-TGGCG GCAGC GGATG TACGT CTGC-3‘,并經GENEBANK中BLAST分析其特異性高,由上海英俊生物技術公司合成。用的限制性內切酶Apa I,總反應體系20μL,包括PCR產物1μg,10×NEB緩沖液2μL,限制性內切酶0.5μL(NEB公司),其余用滅菌雙蒸水填至20μL,65℃(75℃)溫育16h,3%瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色),電泳30 min,紫外線下觀察,攝影。將酶切產物與DNA片斷長度標準物比較以鑒定基因型。同時分析基因多態(tài)性與外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG等相關性。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據處理采用SPSS11.5軟件包進行。群體代表性采用Hardy-Weinberg平衡法進行檢測,計量資料及基因型、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗,計量資料經檢驗為正態(tài)分布者,且方差齊者(均數±標準差)采用t檢驗。檢驗P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因多態(tài)性分析

維生素D受體Apa I基因的PCR擴增產物片段長度為760bp,包含Apa I酶切片段。AA基因型(野生型)不能被酶切斷,僅見740bp1種片段;Aa基因型為雜合子,可見740bp、520bp和220bp3種片段;aa基因型(突變純合子)的擴增產物可被完全切斷,電泳可見520bp和220bp2種片段。

2.2 維生素D受體基因單位點分析

病例組、對照組基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P＜0.05),本研究的樣本來自同一人群,兩組間基因型比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。病例組a等位基因頻率34.04%明顯高于對照組20.41%,差異比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);顯性模型結果顯示,病例組Aa+aa基因型分布頻率高于對照組,差異比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);隱形模型結果顯示,與對照組相比,病例組AA+Aa基因型分布頻率較高,但差異比較不明顯(P＞0.05)(表1,2)。

表1 維生素D受體基因基因型及等位基因的分布

表2 維生素D受體基因顯性及隱性模型分析

2.3 維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關性

維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關性結果顯示:病例組血清IgA水平明顯低于對照組血清IgA水平,兩組間差異比較有統(tǒng)計意義(P＜0.05);且Aa及aa基因型血清IgA水平亦明顯低于對照組血清IgA水平,差異比較亦有統(tǒng)計意義(P＜0.05);其余免疫球蛋白血清水平比較無明顯差異(P＞0.05),見表3。

表3 維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關性

3 討論

流行病學研究已證實[5],身體的任何部位均可受到白癜風的影響,一般而言,白癜風多為雙側對稱分布,我國每100個人中有1～2個人發(fā)病。其中半數在20歲以前就開始出現皮損,且大約1/5的人有家族史。白癜風的主要病理表現為白癜風皮損處完全缺乏黑素細胞及黑素顆粒,基底層多巴染色陽性的黑素細胞缺如[6]。

維生素D受體是一種可以介導1,25(OH),D發(fā)揮生物效應的親核蛋白,是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員之一,維生素D通過與其結合可以調控相應DNA序列結構基因的表達,進而可以參與細胞的增殖、分化等方面的調節(jié)作用[7]。研究發(fā)現[8],Apa l酶切位點位于第VIII內含子上,其多態(tài)性不影響VDR的氨基酸序列,主要通過改變基因的二級以上的結構發(fā)揮作用。

本研究探討白癜風維生素D受體Apa I基因多態(tài)性,結果顯示病例組a等位基因頻率高于對照組,同時顯性模型結果顯示,病例組Aa+aa基因型分布頻率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。孫越等[9]采用聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性方法,對46例白癜風患者和50例健康人的維生素D受體Apa I基因型進行分析。結果顯示VDR-ApaI基因AA,Aa,aa基因型分布頻率在白癜風組分別為6.52%,21.74%,71.74%,對照組分別為12.00%,42.00%,46.00%。維生素D受體Apa I位點上aa基因型在白癜風患者中頻率較高(P=0.036)。且患者組a等位基因分布頻率明顯高于正常對照組(χ2=6.142,P=0.01)。

本研究進一步對Apa I基因多態(tài)性外周血免疫球蛋白的相關性進行研究,結果顯示病例組血清IgA水平明顯低于對照組血清IgA水平,且Aa及aa基因型血清IgA水平亦明顯低于對照組血清IgA水平。分析可能為Aa及aa基因型引起,其中a等位基因為主要原因。孫越等[10]采用聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性方法,對46例白癜風患者和50例健康人的 Apa I 基因多態(tài)性進行分析,以及各基因型與外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG之間的關系。結果顯示Apa I 位點的 aa 基因型在白癜風患者中出現的頻率高于正常對照組(P＜0.05)。Aa、aa 基因型組白癜風患者血清免疫球蛋白IgA 水平顯著低于正常對照組(P＜0.05與P＜0.01)。Ali等[11]檢測白癜風患者血清 IgG、IgA 和 IgM 的水平,與正常人相比,IgG和 IgA水平比較低,而IgM差異不明顯,進一步分析發(fā)現IgG 滴度與患者的白斑數目存在密切的相關性,因此血清免疫球蛋白可能參與了白癜風的發(fā)病。

近年來研究發(fā)現[12-13],白癜風患者血清中存在抗黑素細胞自身抗體,并且抗體滴度與疾病的面積和活動性存在密切的相關性。其發(fā)生機制目前認為是,自身抗體可以通過與黑素細胞膜抗原相結合進而可以發(fā)揮補體的溶解作用對黑素細胞進行破壞[14]。亦有研究發(fā)現[15],白癜風患者皮膚中殘存的凋亡分子Apaf-1可以誘導IgG 在體外促進黑素細胞的凋亡。

綜上所述,本研究提示,維生素D受體Apa I基因多態(tài)性與白癜風的發(fā)生存在密切的相關性,其可能通過影響機體的免疫功能,特別是血清IgA水平發(fā)揮作用。

[1]閔一果,黃永華.維生素D3類似物治療白癜風分子生物學機制及臨床應用現狀[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2012,9(24):162-164.

[2]邱夢桃,余鵬,陳文靜,等.采用微衛(wèi)星標記法對白癜風易感基因的初步篩查研究[J].皮膚性病診療學雜志,2011,18(4):234-236.

[3]張建青,李建軍.白癜風的表觀遺傳學研究進展[J].皮膚性病診療學雜志,2012,17(5):384-386.

[5]張好勤,王培光,胡大雁,等.ZMI Z1區(qū)域單核苷酸多態(tài)性rs11593576與漢族人白癜風臨床表型的相關性研究[J].安徽醫(yī)科大學學報,2011,6(9):934-937.

[6]郭睿,郝雁杰,汪京峽,等.VDR基因多態(tài)性與寧夏回漢族白癜風患者的相關性研究[J].中國實驗診斷學,2012,16(12):2223-2226.

[9]孫越,韓菁,吳瑞勤,等.白癜風患者維生素D受體Apa I,BsmI,Fok I基因多態(tài)性分析[J].中國皮膚性病學雜志,2009,23(11):695-698.

[10]孫越,韓菁,吳瑞勤,等.白癜風患者維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及免疫異常的研究[J].中國中西醫(yī)結合皮膚性病學雜志,2011,10(3):148-151.