荸薺皮中總黃酮物質的提取及其抑菌作用研究

許國權，郭艷華

（江漢大學 a.生命科學學院； b.化學與環境工程學院，湖北 武漢 430056）

荸薺（Eleochairis tuberosa），俗名馬蹄（water chestnut），是莎草科荸薺屬多年水生草本植物的地下球莖，是一種常見的天然經濟作物，自古有地下雪梨之美譽。目前，我國荸薺的栽培面積約為2.7萬hm2，產量占世界的95%以上，長江流域以南各省均有分布。荸薺作為一種優良的藥食同源果蔬食物，多被用來作為食品進行深加工，加工過程中產生了大量的荸薺皮，其質量占鮮荸薺質量的20%～25%。荸薺皮中含有抗菌成分荸薺英，對多種細菌均有不同程度的的抑制作用，其主要成分為酚類、生物堿、有機酸、皂苷及游離黃酮類等成分，荸薺皮中還含有豐富的水溶性棕色素和膳食纖維［1-2］。通過不同的提取條件，采用不同的提取溶劑可以將荸薺皮中不同的成分進行提取，并加以利用，可以為處理廢棄物提供一條新的途徑。國內外對荸薺皮的提取工藝和提取物應用的研究有些報道［3-10］，已證明荸薺皮提取物中黃酮類物質有很好的生理活性和藥理作用，學者們對荸薺皮的提取工藝也進行了一些探討。

筆者在此基礎上對荸薺皮提取物中總黃酮的含量以及抑菌效果進行了研究，相關研究至今未見文獻報道。通過對多種細菌的抑菌試驗探討總黃酮含量與抑菌效果的關系，這對深層次研究荸薺皮中不同的化學成分與抑菌作用間的關系具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

荸薺（武漢市某大型超市購得，孝感產），將荸薺皮自然涼干或在電熱鼓風干燥箱CS101-2A（重慶試驗設備廠）（45℃以下）烘干，用粉碎機粉碎備用。

1.2 主要儀器

旋轉蒸發器RE-2000A（上海亞榮生化儀器廠），循環水式多用真空泵SHB-ⅢA（上海豫康科教儀器設備有限公司），微型植物粉碎機FZ102（天津市泰斯特儀器有限公司），電熱真空干燥箱2K-60AB（上海申光儀器有限公司），恒溫培養箱DHP120（上海實驗儀器廠有限公司），電子天平JA5003B（上海越平科學儀器有限公司），超凈工作臺SHJ-875（上海實驗儀器廠有限公司），立式壓力蒸氣滅菌器YXQ-LS-50S11（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），恒溫培養振蕩器HNY-100B（天津市歐諾儀器儀表有限公司），數顯恒溫水浴鍋HH-4（國華電器有限公司）、電熱真空干燥箱ZKF030（上海實驗儀器廠有限公司），752分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 試劑及用品

乙酸、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、醫用酒精，以上試劑均為分析純。

實驗菌種：大腸埃希菌（Eschercihia Coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）均從華中農業大學購得。

1.4 試驗方法與過程

1.4.1 標準溶液與樣品溶液的制備 準確稱取105℃下烘至恒重的蘆丁標準樣品20.00 mg，用30%乙醇溶解并定容至100 mL，搖勻，得濃度為0.200 mg/mL的蘆丁標準溶液。

稱取若干份10.000 g荸薺皮粉按照不同料液比（g/mL）分別加入75%乙酸溶液中，在不同溫度下用恒溫水浴鍋加熱浸提若干小時，用定量濾紙趁熱負壓抽提過濾，濾渣再加入相應的溶劑二次浸提，再過濾，合并兩次所得濾液，得荸薺皮樣品溶液（即粗提液），另將粗提液蒸餾得到膏狀提取物用30%乙醇溶解配制成0.2 g/mL的溶液備用。

取干荸薺皮均為10.000 g，以提取時間、提取溫度、料液比為因素進行L（933）正交試驗。進一步確定適宜提取工藝條件。L（933）正交試驗：按正交試驗3因素水平表（見表1）進行L（933）正交試驗，以確定荸薺皮總黃酮物質提取的適宜條件。

表1 正交試驗因素水平表

1.4.2 蘆丁標準曲線的繪制 準確吸取上述蘆丁標準溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加5%NaNO20.75 mL，搖勻放置5 min，加10%Al（NO3）30.75 mL搖勻，放置 6 min，加1 mol/L的NaOH溶液5.0 mL，搖勻，用30%乙醇定容，搖勻，放置10 min后，在510 nm處測吸光度，以吸光度為橫坐標，蘆丁標準溶液濃度為縱坐標，繪制標準曲線，求回歸方程。

1.4.3 樣品中總黃酮含量的測定 取各樣品粗提液1 mL加到25 mL容量瓶中，加入0.75 mL的5%NaNO2搖勻后放置5 min，加入0.75 mL 10%Al（NO3）3放置6 min，再加入5.0 mL 1 mol/L 的NaOH溶液，用30%乙醇溶液定容至刻度，搖勻后放置10min，510 nm紫外光下測吸光度，用空白作對照。

式（1）中：C為根據回歸方程計算出的稀釋后的荸薺皮樣品溶液的總黃酮濃度（mg/mL）；V為荸薺皮樣品提取粗提液體積（mL）；m為荸薺皮粉樣品質量（g）。

1.5 抑菌效果測定方法

濾紙片法測定荸薺皮提取物的抑菌率［11-13］。將蒸餾所得的荸薺皮提取物用30%乙醇制成0.2 g/mL的溶液進行抑菌活性試驗。將已滅菌的小圓濾紙片（D 6 mm）浸于荸薺皮提取物中60 min，風干，制成樣品濾紙片。用無菌移液器取0.2 mL的試驗菌菌懸液分別加到培養皿平板中，用無菌三角涂棒涂布均勻，在每個平板貼3～4片相同濃度成分的小圓濾紙片，貼完編號；再將上述貼好濾紙的含菌平板倒置放入培養箱中培養，細菌放置在37℃下培養，細菌培養16 h后取出測量抑菌圈的大小，通過多次試驗取平均值。

1.6 數據的處理統計分析

用Excel對所得數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線與回歸方程

在測量波長510 nm處測定吸光度值，以蘆丁濃度—吸光度值作標準曲線，得回歸方程：C=0.1001A+0.0004（C為蘆丁濃度，單位為mg/mL，A為吸光度），相關系數R2=0.9993；蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溶劑對總黃酮得率的影響 按照料液比1∶12，在50℃浸提5 h，以蒸餾水、65%乙醇、75%乙醇、75%乙酸、乙醇—乙酸（體積比3∶1）為提取溶劑，從圖2可以看出，75%乙酸提取所得總黃酮得率最高，為1.46%，其次是75%乙醇，蒸餾水提取的得率最低，因此，以乙酸作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對總黃酮得率的影響

2.2.2 乙酸濃度對總黃酮得率的影響 用36%～80%的乙酸為浸提溶劑在料液比1∶12、溫度70℃條件下浸提5 h，從圖3可以看出，隨著乙酸濃度增加，總黃酮得率也增加，在乙酸濃度達到75%時，總黃酮提取物得率最大，得率達到1.5%，當濃度達到80%時，提取效果反而降低。因此，本試驗以75%的乙酸為浸提溶劑。

圖3 提取濃度對總黃酮得率的影響

2.2.3 料液比對總黃酮得率的影響 料液比會影響提取溶劑對活性物質的溶解。料液比比值過高，活性物質不能充分溶解，使得提取率降低；料液比比值過低，雖然可以充分溶解活性物質，但是成本較高。因此選擇適宜的料液比可以兼顧提取率和成本。從圖4可以看出，75%的乙酸在70℃下不同料液比浸提5 h條件下浸提，總黃酮得率在1∶8～1∶12范圍內呈上升趨勢，在1∶12時達到峰值，為1.50%；但料液比為1∶14時反而低于1∶12時。因此，選擇料液比為1∶12為適宜的料液比。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響

2.2.4 提取溫度對總黃酮得率的影響 溫度越高，物體分子運動越劇烈，活性物質越容易釋放到浸提溶劑中來。75%的乙酸按照料液比1∶12在40～90℃條件下浸提5 h，從圖5可以看出，隨著提取溫度升高，總黃酮得率增加，在40～60℃范圍內變化幅度小一些，在60～80℃范圍內變化幅度較大，并在80℃時達到峰值，為1.44%，之后呈下降趨勢，由于溫度過高對黃酮類物質的活性也會有影響，因此選擇70℃為適宜提取溫度。

圖5 提取溫度對總黃酮得率的影響

2.2.5 提取時間對總黃酮得率的影響 提取時間影響到溶劑與被提取物充分接觸與否，被提取物是否能夠被萃取并充分釋放出來，當然長時間提取會造成總黃酮物質的分解或轉化而使得率降低。用75%的乙酸為浸提溶劑在料液比1∶12、溫度70℃條件下提取時間3～8 h。從圖6可以看出，提取3～5 h時，得率呈現上升趨勢，5 h總黃酮的得率最大，為1.56%，4 h和5 h比較接近，之后總黃酮得率開始下降；因此，選擇提取時間以4～5 h為宜。

2.3 提取條件優化試驗結果

圖6 提取時間對總黃酮得率的影響

根據單因素試驗的結果，確定以料液比，提取溫度、提取時間等3個因素進行正交試驗，結果見表2。由表2的極差分析可知，料液比，提取溫度、提取時間3個因素對總黃酮提取量影響的主次順序為：提取溫度＞料液比＞提取時間，從荸薺皮中提取總黃酮的適宜工藝是C2B3A3，即提取溫度為70℃、提取時間為6 h、料液比為1∶14，在此條件下，從荸薺皮中提取到總黃酮的得率為1.56%。

2.4 總黃酮提取物對細菌的抑菌效果

2.4.1 不同總黃酮含量的提取物對細菌的抑菌效果 從表3可以看出，提取物對大腸埃希菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌都有很強的抑菌作用，對大腸埃希菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用相當，對銅綠假單胞菌的抑菌作用稍弱；但是從抑菌效果與總黃酮含量的關系來看，總黃酮含量的多少與抑菌效果沒有明顯相關性，因此可以推斷在提取物中起抑菌作用的物質不完全是黃酮類物質。

表2 正交試驗結果

表3 不同總黃酮含量的提取物對4種細菌的抑菌效果/mm

2.4.2 不同浸提溫度的提取物對細菌的抑菌效果

從表4可以看出，50～80℃下提取所獲得的提取物對大腸埃希菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌4種細菌的抑菌作用沒有線性關系。

3 結論

通過正交試驗確定了用75%的乙酸從荸薺皮中提取總黃酮類物質的適宜工藝條件：提取溫度為70℃、料液比為1∶14，提取時間為6 h，在此條件下，從荸薺皮中提取到總黃酮的得率為1.56%。

表4 不同提取溫度所獲得提取物對4種細菌的抑菌效果/mm

從荸薺皮中的提取物總黃酮對大腸埃希菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌4種細菌均有較強的抑菌作用，但是總黃酮含量的多少與抑菌效果沒有明顯相關性，因此可以推斷在提取物中起抑菌作用的物質不僅是黃酮類。50～80℃下浸提所獲得的提取物對4種細菌的抑菌作用也沒有線性關系。

用乙酸浸提過程中，隨著乙酸濃度增大，粗提液的顏色越深，當乙酸濃度達到75%時，粗提液的顏色最深，濃度再升高時顏色反而變淺；隨著浸提溫度的升高，粗提液的顏色也越來越深，顏色由淡黃色向深褐色變化；提取時間對粗提液的顏色影響不大。這主要是荸薺皮中的黃酮類色素隨著提取溫度和溶劑濃度的升高被大量提取出來，從正交試驗的結果也可以反映出來。

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