survivin在非小細胞肺癌惡性胸腔積液中表達的研究及其臨床意義

文昱婷 朱穎 楊旸 楊健 張秀偉

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在工業發達國家，肺癌發病率已位居各種惡性腫瘤的首位。一項我國惡性腫瘤死亡率回顧性研究表明，惡性腫瘤死亡率呈上升趨勢，目前，肺癌成為我國男性和女性惡性腫瘤的頭號殺手［1-2］。肺癌是一種基因性疾病，癌基因的激活或者抑癌基因的失活導致細胞異常增殖和凋亡障礙，是肺癌發生發展的關鍵。survivin于1997年被發現，是一種調節細胞周期和程序性死亡的蛋白，在大多數腫瘤中高表達，且研究發現survivin在肺癌的發生、發展中起著重要的作用，成為目前肺癌研究領域的一個新熱點［3-4］。NSCLC患者胸腔積液的出現通常意味著疾病的嚴重性和患者較短的生存期，惡性胸腔積液的早期診斷與肺癌的治療及預后關系密切，且不同的病理類型對治療的反應各不相同。尋找胸腔積液中高敏感性、高準確性的標志物來早期診斷良、惡性胸水仍然是臨床研究的熱點。本研究通過western blot法研究NSCLC惡性胸腔積液中survivin的表達情況及其與相關臨床特征的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2011年1月至2012年6月在我院確診惡性胸腔積液48例，其中男32例，女16例，年齡51～89歲，中位年齡為68歲，均經胸腔積液脫落細胞學、纖維支氣管鏡病理活檢或經皮肺穿刺細胞學等方法得到病理學證實為NSCLC患者。組織學分型，腺癌患者41例，鱗癌患者7例。均為初診患者。所有病例排除其他癌癥，采取標本之前未行抗癌治療。對照組30例，男24例，女6例，年齡24～80歲，中位年齡為59歲。其中結核性胸膜炎14例，肺炎旁胸腔積液及膿胸8例，心功能不全8例。

1.2 試劑與方法

1.2.1 一抗:Rabbit polyclonal anti-survivin購自美國Santa Cruz公司;二抗:IRDyeTM800 Conjugated anti-Rabbit/Mouse second antibody購自美國 Rockland公司。

1.2.2 標本的處理:取胸腔積液標本200～400 ml，恒溫離心，3000 r/min，10 min，收集沉淀細胞，如血性標本用低滲氯化銨溶液去除紅細胞。取部分沉淀細胞涂片，涂片經預冷丙酮固定干燥后置于－20℃冰箱保存待測。

1.2.3 western blot法:取－20℃保存的沉淀細胞，預冷PBs洗3次，用RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白。用Bradford法行總蛋白定量。調整每個泳道上樣量為20 μg左右。聚丙烯酰胺凝膠電泳:采用5%積層膠和10%分離膠;積層膠電泳電壓為60 V，分離膠電泳電壓為120 V，總計電泳時間為2 h左右。脫脂牛奶封閉PVDF膜，蛋白上樣量分別為50 μg，一抗(Rabbit polyclonal anti-MACC-1)濃度為1∶400，與辣根過氧化物酶標記的二抗(二抗濃度為1∶400)結合，ECL試劑發光，X膠片曝光，顯影、定影，將條帶掃描進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件，計數資料采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC惡性胸腔積液與對照組survivin蛋白水平比較 48例NSCLC患者惡性胸腔積液中，survivin陽性表達為 37例，陰性表達為 11例，陽性率為77.08%。在對照組中無 survivin陽性表達者。見圖1。

2.2 不同性別、病理類型的NSCLC患者惡性胸腔積液survivin表達比較 在survivin陽性表達的37例中，腺癌和鱗癌的陽性表達例數分別為33例(80.49%)和 4例(57.14%)，差異無統計學意義(P＞0.05)。男性和女性的陽性表達例數分別為27例(84.38%)10例(62.50%)，差異亦無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 NSCLC患者惡性胸腔積液中survivin表達對預后的影響 在隨訪周期內采用門診復查和電話相結合的方式進行隨訪，其終點為病變進展或死亡。結果顯示，survivin陽性表達者預后明顯不佳(P＜0.01)。見表1。

表1 NSCLC患者惡性胸腔積液中survivin表達與臨床特征關系

3 討論

導致胸腔積液的原因很多，常見原因有原發性肺癌、肺結核等多種疾病，近年來，肺癌的發病率呈上升趨勢，惡性胸腔積液明顯增多，尤以肺腺癌更易發生胸膜轉移。胸腔積液的良、惡性鑒別要依靠細胞學檢查，但其敏感性低、難以滿足臨床需要。因此需要尋求新的診斷方法，胸腔積液中腫瘤標志物的檢測成為了肺癌診斷和鑒別診斷的重要手段。

survivin具有抑制細胞凋亡和調節細胞分裂的雙重功能，能抑制 Fas、bax及caspase-7和化療藥誘導的細胞凋亡［5］。survivin的基本作用之一是抑制細胞凋亡，同時參與有絲分裂的調控［6］，且僅在有絲分裂過程中表達。免疫組化研究結果已經證明survivin可能存在于人類多種腫瘤細胞核和細胞質中，其在腫瘤細胞核中的表達顯示臨床預后不佳［7］。在正常生理條件下survivin的表達局限于胚胎、造血、上皮細胞和性腺細胞系。但在多種癌癥中發現survivin高表達，包括96%的肺癌、100%的結腸腺癌、71%的前列腺腺癌、80%的膠質母細胞瘤，和100%的喉癌標本［8-10］，因此可作為腫瘤診斷的新指標。survivin基因在肺癌診斷中的意義國內外均有報道，但其在NSCLC惡性胸腔積液中檢測結果及其臨床意義的報道較少。

本研究顯示，NSCLC患者惡性胸腔積液中survivin表達的陽性率為77.08%，而在非惡性胸腔積液中無表達，提示survivin在NSCLC惡性胸腔積液中表達上調。由于survivin蛋白是凋亡抑制蛋白，具有抑制細胞凋亡的功能，在腫瘤細胞或核異型等細胞中明顯表達，而正常的細胞中幾乎無或很少表達，故惡性胸腔積液中survivin蛋白的檢出陽性率明顯高于良性胸腔積液。因此檢測 survivin可能具有早期診斷價值，并可能成為一個新的惡性胸腔積液診斷標志。

有研究表明，survivin的表達與NSCLC的預后相關［11］，而 Huang 等［12］根據系統性文獻回顧亦得出，survivin的高表達提示NSCLC患者的預后較差。本研究結果證實，NSCLC惡性胸腔積液中未表達survivin者生存時間明顯長于陽性表達者，表明檢測survivin對預測肺癌預后有一定的價值，也可以作為預后不良的指標之一。

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