白藜蘆醇聯合5-氟尿嘧啶抗腫瘤活性的研究

李冬梅，張淑珍，車 薇，張紅果

腫瘤一直是危害人類生命的頑疾之一，合理配伍生物調節劑、增效減毒是目前腫瘤治療研究領域一個積極的探索方向，特別是中藥提取物與化療藥聯合應用，能夠提高抗腫瘤的療效。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)為非黃酮類的多酚化合物，廣泛分布于多種植物中。近年來，國內外學者研究發現，Res具有多種生物活性，其抗腫瘤作用引起廣泛關注，是最具有希望的天然腫瘤預防劑之一［1-2］。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是腫瘤治療常用的化療藥物，但其毒副作用較大，可造成機體免疫功能低下［3］，限制了其臨床應用。本研究通過觀察Res合用5-Fu的抗腫瘤活性，證實二者對腫瘤的聯合治療作用，以期為臨床應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級昆明種小鼠，雄性，體質量(20±2)g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(冀)2008-1-003。瘤源:荷 S180肉瘤(腹水型)小鼠，為接種腫瘤細胞7 d后生長良好的荷瘤動物，由河北省實驗動物中心傳代保存。

1.2 藥品和試劑 Res(純度≥98%)、5-Fu(純度≥99%)、DMEM培養基、胎牛血清、刀豆蛋白 A(ConA)、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)，均為Sigma-Aldrich公司產品。淋巴細胞分離液，密度:1.077 g/mL，Axia-Shield公司產品。DMEM培養基加入胎牛血清配成濃度10%的完全培養液;MTT用DMEM培養液配成0.5%的溶液，微孔濾膜除菌。

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養箱，TS100-F-PH型倒置熒光相差顯微鏡，AC100-110型酶標儀。

1.4 方法

1.4.1 藥物的配制 體外試驗:將Res和5-Fu分別用DMSO溶解，微孔濾膜除菌，以含10%胎牛血清的完全培養液稀釋成所需濃度。體內試驗:將Res和5-Fu分別用DMSO溶解，均以生理鹽水稀釋成所需濃度，現用現配。

1.4.2 Res合用5-Fu對體外脾細胞增殖的影響

按MTT法進行。取正常小鼠，脫頸椎處死，無菌制備單個脾細胞懸液，用培養液洗滌、懸浮沉淀，沿管壁緩緩加至淋巴細胞分離液上，離心，取液體中間層呈云霧狀的淋巴細胞，用培養液洗滌，以含10%胎牛血清的完全培養液懸浮沉淀，置37℃、5%CO2培養箱中培養。培養12 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態。加入完全培養液至細胞含量為107/mL。在96孔細胞培養板中，每孔加入細胞懸液100 μL，培養12 h后，分別加入50 μL 系列濃度的藥物，藥物組分為 Res組(0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)、5-Fu 組 (0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)、Res+5-Fu 組。再加入 50 μL ConA(終質量濃度 10 μg/mL)，空白組加入等體積的DMEM培養液，每個樣品均設3個復孔。繼續培養，于68 h取出培養板，每孔加入MTT液20 μL，繼續培養4 h，吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩5 min，酶標儀490 nm處檢測OD值。

1.4.3 Res合用5-Fu對S180抑瘤活性的影響將荷瘤小鼠(瘤株)脫頸椎處死，于無菌條件下吸取腹水，按照腹水∶生理鹽水=1∶4的比例進行稀釋，將稀釋后的腹水按每只0.2 mL(腫瘤細胞數約5×109/L)接種于動物右側腋窩皮下。接種后24 h，按體質量隨機分為4組:模型組(等量生理鹽水)、Res組(20 mg/kg)、5-Fu 組(20 mg/kg)、Res合用5-Fu組(Res 20 mg/kg+5-Fu 20 mg/kg)，每組10只。各組均腹腔注射給藥，1次/d，連續10 d，每天觀察小鼠的活動情況。末次給藥24 h后，各組動物稱重，脫頸椎處死，取瘤體稱重并比較各組差異，計算抑瘤率:抑瘤率(%)=［(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重］×100%;另取胸腺和脾臟稱重，計算胸腺指數和脾指數。

1.5 統計學處理 采用SPSS 15.0軟件進行分析，數據以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Res合用5-Fu對體外脾細胞增殖的影響Res單用劑量≥0.1 μg/mL，5-Fu單用劑量≥0.1 μg/mL，以及二者合用時，對淋巴細胞增殖均表現出較強的抑制活性(P＜0.05或P＜0.01)，且抑制作用隨藥物濃度的增加而提高。結果見表1。

表1 Res合用5-Fu對ConA誘導的脾細胞增殖的影響(n=3)

2.2 Res合用5-Fu對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

各藥物組荷瘤小鼠的體質量增長均較模型組低，其中Res合用5-Fu組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。各藥物組瘤重與模型組相比均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，Res合用5-Fu組與單用組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。Res合用5-Fu的抑瘤率達到41%，明顯大于單用Res或5-Fu。結果見表2。

表2 Res合用5-Fu對S180荷瘤小鼠體質量及瘤重的影響

2.3 Res合用5-Fu對S180荷瘤小鼠免疫器官的影響 單用Res對免疫器官指數影響不顯著，單用5-Fu可導致免疫器官腎臟和胸腺出現不同程度的萎縮(P＜0.05或P＜0.01)。Res合用5-Fu可提高脾指數和胸腺指數，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，與5-Fu組比較差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。結果見表3。

表3 Res合用5-Fu對S180荷瘤小鼠免疫器官的影響

3 討論

由于放化療不良反應嚴重，尋找以增效減毒為目標的多元化腫瘤治療方案是目前抗腫瘤領域的重要研究課題之一。目前，國內外已對Res預防和抑制腫瘤的作用進行了較為深入的研究，發現Res對乳腺癌、胃癌、白血病、鼻咽癌、肝癌、大腸癌等都有較好的抑制作用［4-5］;對腫瘤細胞具有選擇性作用，可在不同階段通過抑制腫瘤始發的突變、抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞的凋亡等方面起作用［1，6］。5-Fu是臨床上治療腫瘤的常規化療藥物，但該藥在殺傷瘤細胞的同時，也導致腫瘤患者免疫低下［7-8］，而免疫功能低下又可促進腫瘤的發生和發展。本研究探討了二者聯合應用的抗腫瘤作用。

本研究通過觀察Res合用5-Fu對ConA誘導小鼠脾細胞增殖的影響，結果表明，Res合用5-Fu對小鼠脾細胞增殖有顯著的抑制作用，且其作用隨濃度增加而增強;陳素梅等［9］研究認為，Res與化療藥聯合應用，可明顯加強對胰腺癌細胞增殖和凋亡的抑制，比單用抑制作用更強。本研究通過觀察Res合用5-Fu對小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用，結果表明，Res合用5-Fu能明顯抑制荷瘤小鼠的實體瘤重，抑瘤率高于單用Res或5-Fu，說明二者聯合使用有一定的協同作用。這與孫中杰等［10］的研究結果相似，其研究認為，Res在體內具有抑制小鼠肝癌H22的作用，與5-Fu聯合具有協同作用，能夠增強5-Fu抑制小鼠肝癌H22的作用。改善免疫功能低下也有利于腫瘤治療。本研究發現，Res合用5-Fu對5-Fu所致的免疫器官萎縮有保護作用，提示二者配伍增強了荷瘤小鼠對腫瘤和外界刺激的反應能力。這與劉紅山等［11］認為，Res對5-Fu所致小鼠白細胞減少、免疫器官萎縮等毒副反應具有保護作用的研究結果一致。

綜上所述，Res與5-Fu聯合應用具有較好的抑瘤效果，并能影響動物的免疫功能，說明二者合用抗腫瘤有協同作用。

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［11］ 劉紅山，潘承恩，齊詠，等.白黎蘆醇合用5-FU對小鼠移植肝癌H22生長的影響［J］.世界華人消化雜志，2002，10(1):32-35.