鞘內(nèi)注射羅哌卡因-葡萄糖液對(duì)大鼠脊髓蛋白質(zhì)組的影響

李 林，張鐵錚*，刁玉剛，王俊科

近30年來，局麻藥毒性導(dǎo)致的損傷發(fā)生率已顯著降低，但中軸神經(jīng)(Central neuraxial)損傷作為臨床麻醉與疼痛治療中的嚴(yán)重并發(fā)癥，一直受到學(xué)術(shù)界的持續(xù)關(guān)注［1-2］。據(jù)Brull報(bào)道，圍術(shù)期中軸神經(jīng)阻滯相關(guān)神經(jīng)損傷發(fā)生率可達(dá)0.4%，而因局麻藥毒性直接導(dǎo)致的化學(xué)損傷是危險(xiǎn)因素之一［3］。已知局麻藥的濃度、劑量、暴露時(shí)間等因素與其神經(jīng)毒性顯著相關(guān)［4］;而局麻藥種類、酸堿度和比重、配制藥液所用葡萄糖等因素如何影響其神經(jīng)毒性還存在爭(zhēng)論［5］。目前臨床上仍常以葡萄糖液與局麻藥混合用于椎管內(nèi)麻醉［6］，同時(shí)有部分在使用了葡萄糖配制的局麻藥后出現(xiàn)相關(guān)神經(jīng)并發(fā)癥的報(bào)道［7-8］。對(duì)于預(yù)先存在神經(jīng)病理學(xué)改變，例如糖尿病性多處神經(jīng)病變(Diabetic polyneuropathy)的患者，局麻藥的選擇及是否應(yīng)用葡萄糖配制尚無定論［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)擬采用一種改良的經(jīng)腰椎鞘內(nèi)置管方法，將葡萄糖配制的等比重羅哌卡因注入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，觀察其對(duì)大鼠行為學(xué)指標(biāo)及脊髓的蛋白質(zhì)組的影響，為研究混合葡萄糖液的羅哌卡因脊神經(jīng)毒性的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 獲沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取健康成年雄性SD大鼠36只，按抓取順序隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(N組)、0.5%羅哌卡因組(R1組)、由葡萄糖稀釋的0.5%羅哌卡因組(R2組)，每組12只。

1.2 主要儀器設(shè)備 超聲波破碎儀(Sonics＆Materials公司，美國(guó))、低溫離心機(jī)(Z-333-MK-2型，HERMLE公司，德國(guó))、Ettan IPG phorⅢ等電聚焦系統(tǒng)(GE公司，美國(guó))、Ettan DALT six大型垂直電泳單元(GE公司，美國(guó))、Ettan spot picker全自動(dòng)切點(diǎn)儀(GE公司，美國(guó))、MALDI-TOF質(zhì)譜分析儀(autoflexⅢ型，Bruker公司，德國(guó))

1.3 藥品和試劑 1%鹽酸羅哌卡因注射液(AatraZeneca公 司，瑞 典，批 號(hào):KK1701)，0.5%鹽酸羅哌卡因注射液(AatraZeneca公司，瑞典，批號(hào):HC1921)，10%葡萄糖溶液(沈陽(yáng)志鷹制藥廠，批號(hào):081215)，0.9%氯化鈉溶液(沈陽(yáng)志鷹制藥廠，批號(hào):090211);2D-cleanup蛋白質(zhì)提純及定量試劑盒(GE公司，美國(guó))，2%IPG上樣緩沖液，考馬斯亮藍(lán) R-350，基質(zhì)HCCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid， #201344、#203072)，PEP 肽標(biāo)(Peptide calibration standard Ⅱ，#222570)(Bruker公司，德國(guó))。

1.4 鞘內(nèi)置管及給藥方法 向大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(100 mg/kg)麻醉，依改良的經(jīng)腰椎穿刺法沿 L3-4間隙向尾端行鞘內(nèi)置管，深度1.5 cm。縫扎固定導(dǎo)管，外端以熱熔蠟封閉。3 d后經(jīng)導(dǎo)管向蛛網(wǎng)膜下腔注射2%利多卡因20 μL，注藥后30 s未出現(xiàn)雙下肢麻痹或超過30 min未恢復(fù)的大鼠舍去不用。取符合要求的大鼠再飼養(yǎng)3 d后，按組別經(jīng)PE-10導(dǎo)管分別注入0.9%氯化鈉溶液(N組)、0.5%羅哌卡因(R1組)或10%葡萄糖+等體積1%羅哌卡因配制成的0.5%羅哌卡因(R2組)。每次注入40 μL，時(shí)間約10 s。每間隔1.5 h一次，共3次。每次注藥后給予0.9%氯化鈉溶液10 μL沖洗導(dǎo)管。

1.5 行為學(xué)指標(biāo)測(cè)定 采用RBP-1B型大鼠血壓計(jì)，對(duì)每只大鼠首次注藥前5 min及每次注藥后10 min測(cè)一次血壓。若SBP＜90 mmHg則舍去不用。在上述時(shí)點(diǎn)觀察其呼吸、飲水、進(jìn)食等情況，有無抽搐、昏迷、死亡等。在蛛網(wǎng)膜下腔置管后1 h、末次注藥后1 h及24 h，以 Basson-Beattle-Bresnahan Rating Scale(BBB神經(jīng)功能評(píng)分法)及斜板試驗(yàn)記錄運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況:(1)斜板試驗(yàn):將大鼠放置在木質(zhì)斜板上，身體縱軸與斜板縱軸一致;斜板每次升高5度，記錄大鼠能停留5 s的最大角度，以評(píng)估其肌力變化情況。(2)BBB神經(jīng)功能評(píng)分:將大鼠置于直徑2 m的平面光滑場(chǎng)地中，允許其自由活動(dòng)。由熟悉評(píng)分法則的非本實(shí)驗(yàn)人員雙人獨(dú)立觀察4 min，記錄大鼠后肢的關(guān)節(jié)活動(dòng)、步態(tài)等運(yùn)動(dòng)功能并進(jìn)行評(píng)分，記錄其均值。

1.6 蛋白質(zhì)組學(xué)研究 末次評(píng)分完成后24 h斷頭法處死大鼠，迅速暴露脊髓，以導(dǎo)管尖端為中心切取5 mm的脊髓段，用2D-cleanup試劑盒提取組織蛋白并測(cè)定濃度，確定上樣體積。依GE公司雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案順序進(jìn)行第一向水平等電聚焦電泳(上樣量為800 μg/膠條，溫度20℃，電流強(qiáng)度50 μA/膠條)及第二向垂直SDS-PAGE電泳(采用12.5%的均一濃度丙烯酰胺凝膠，電泳條件為1 V/塊凝膠，時(shí)間17～20 h)。分離后的凝膠經(jīng)固定及考馬斯亮藍(lán)染色后，掃描圖像傳輸至電腦。用ImageMaster 2D platinum 6.0軟件進(jìn)行分析:以對(duì)照組凝膠為參考膠，與兩實(shí)驗(yàn)組比較，選擇差異在2倍以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)生成切點(diǎn)列表，Ettan spot picker自動(dòng)切膠。膠粒反復(fù)脫色及脫水后加胰酶液酶解，加萃取液提取肽混合物點(diǎn)靶。

MALDI-TOF MS分析:正離子譜測(cè)定，激光源波長(zhǎng)337 nm，誘導(dǎo)碰撞電壓20～45 V，每4個(gè)樣品蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行一次肽標(biāo)校正。使用MASCOT搜索引擎(http://www.matrixscience.com;Matrix Science，London，UK)進(jìn)行生物信息搜索。數(shù)據(jù)庫(kù)為SwissProt 57.12，種屬選擇Rattus，蛋白酶為胰蛋白酶，靜態(tài)修飾選擇半胱氨酸羧氨甲基化，動(dòng)態(tài)修飾選擇氧化，肽段質(zhì)量范圍在±100 ppm，最大允許丟失的酶切位點(diǎn)為1個(gè)，當(dāng)MASCOT評(píng)分＞51分時(shí)認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 36只大鼠在觀測(cè)期內(nèi)生存良好，無意外死亡。術(shù)前各組體質(zhì)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);N組及R1組在各時(shí)點(diǎn)收縮壓變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);R2組在末次給藥后收縮壓較基礎(chǔ)值有所下降(P＜0.05)，同時(shí)點(diǎn)數(shù)據(jù)組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表 1。

2.2 行為學(xué)指標(biāo) N組、R1組在各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);R2組在給藥后兩項(xiàng)指標(biāo)略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.3 雙向電泳及質(zhì)譜分析結(jié)果 在相同實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)設(shè)置條件下，每組各進(jìn)行3次雙向電泳分離并建立平均凝膠圖(圖1～3)。分別將R1、R2組與N組配對(duì)比較，N-R1組無差異蛋白點(diǎn)得到確認(rèn);N-R2組共有6個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢確認(rèn)對(duì)應(yīng)3種蛋白質(zhì)。表2為N-R2組差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)初步鑒定結(jié)果。圖4為N-R2組第212號(hào)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的TOF-MS分析圖，經(jīng)鑒定該點(diǎn)為NAD依賴的去乙酰化酶2(沉默調(diào)節(jié)蛋白，SIRT2)。

表1 大鼠一般狀況及給藥前后行為學(xué)指標(biāo)變化(n=12)

表2 N-R2組雙向電泳差異表達(dá)蛋白質(zhì)列表

圖4 N-R2組第212號(hào)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)TOF-MS分析圖

3 討論

在理論上曾認(rèn)為，向局麻藥中添加高濃度葡萄糖可延長(zhǎng)局麻藥作用時(shí)間，但同時(shí)增加其神經(jīng)毒性。Hashimoto通過對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔插管并輸注5%利多卡因、10%的葡萄糖或0.9%氯化鈉溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利多卡因組出現(xiàn)持久的感覺損害，另外兩組均未發(fā)生類似變化。因而認(rèn)為臨床濃度的葡萄糖不產(chǎn)生神經(jīng)損傷，神經(jīng)毒性來自局麻藥本身。Zekiye等［12］分別用葡萄糖液配制重比重的羅哌卡因及布比卡因并將其用于椎管內(nèi)麻醉，實(shí)驗(yàn)中未觀察到脊神經(jīng)損傷發(fā)生。筆者用10%的葡萄糖+等體積的1%羅哌卡因配制所得等比重0.5%的羅哌卡因糖溶液進(jìn)行研究，結(jié)果大鼠行為學(xué)指標(biāo)的改變不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Hashimoto及Zekiye等的研究結(jié)論基本一致。

雙向電泳-質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，由葡萄糖稀釋的0.5%羅哌卡因組2-DE圖譜斑點(diǎn)的表達(dá)有明顯差異。經(jīng)質(zhì)譜分析確認(rèn)了3種蛋白質(zhì)，即豐度升高的ALDR和GS，及豐度降低的SIRT-2。

ALDR是高糖狀態(tài)下多元醇通路(Polyol pathway)的限速酶，在非高糖狀態(tài)下可介導(dǎo)細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)、調(diào)整細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)等［13-14］。作為機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵酶，ALDR在由葡萄糖配制的0.5%羅哌卡因組大鼠脊髓中表現(xiàn)出升高，這種變化值得深入研究。

既往研究表明，在脊髓損傷的情況下，幼齡大鼠可通過下調(diào)谷氨酸受體水平來保護(hù)細(xì)胞免于谷氨酸鹽的傷害［15］。本實(shí)驗(yàn)中觀察到的大鼠脊髓中GS表達(dá)上調(diào)，或許是阻止/緩解神經(jīng)元興奮性中毒變性進(jìn)展的另一種途徑。

沉默信息調(diào)控子2(The silent information regulator 2，SIR2)是一種高度保守的NAD依賴性的組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶。SIRT2是SIR2的同源體，定位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)。Matsushita等［16］的研究認(rèn)為，SIRT2通過將微管蛋白去乙酰化來阻礙少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，從而避免細(xì)胞過分化和早老。這種負(fù)性調(diào)節(jié)作用可以使中樞神經(jīng)系統(tǒng)保有必要的未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，以滿足其自身修復(fù)的需要。對(duì)于已經(jīng)存在的脊神經(jīng)病變，SIRT2的下調(diào)可能影響其神經(jīng)功能的恢復(fù)。對(duì)此類患者應(yīng)用葡萄糖配制的羅哌卡因則可能加重局麻藥的脊神經(jīng)毒性。未來應(yīng)以糖尿病大鼠模型為對(duì)象展開研究，以期得出更明確的結(jié)論。

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