Apelin-13對腎上腹主動脈縮窄誘導的心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響

楊 攀，張 志

(1盤錦市中心醫院，遼寧盤錦124000;2遼寧醫學院附屬第三醫院)

心肌纖維化(MF)是多種心血管疾病發展到一定階段的共同病理改變，亦是心室重構的主要表現之一。MF可破壞心肌細胞間的耦聯，降低毛細血管密度，增加心肌硬度，致心臟舒張順應性降低，是心力衰竭發生的重要危險因素［1］。近年研究發現［2］，Apelin/APJ信號系統在心血管系統高度表達，在降低血壓、改善心功能、保護心肌細胞、促進血管生成等方面有重要作用。但目前對Apelin在心力衰竭治療中的作用是否與抑制MF有關尚不清楚。2011年10月～2012年10月，我們通過腎上腹主動脈縮窄法建立大鼠心力衰竭模型，觀察外源性給予Apelin-13對大鼠MF的影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠40只，體質量220～270(250±10)g，由遼寧醫學院動物實驗中心提供;常溫低速離心機、BioRad圖像分析系統、倒置相差電子顯微鏡;Apelin-13(Sigma公司，美國)，大鼠Apelin-13，TGF-β1、BNP、MMP2、TIMP-1酶聯免疫(ELISA)試劑盒(RapidBio Lab，美國)，Masson 染色試劑，辣根過氧化酶標羊抗兔IgG(天津TBD生物技術有限公司)，D-Hanks緩沖液，10%甲醛溶液。

1.2 模型制備及實驗方案 將40只大鼠隨機分為4組各10只，適應性喂養1周后按文獻［3］中的腎上腹主動脈縮窄法建立慢性心力衰竭模型:2%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，剃毛，打開腹腔并分離腹主動脈，分離組織，用內徑0.7 mm銀夾造成腹主動脈狹窄，分層關閉腹腔;假手術組僅分離腹主動脈未用銀夾夾閉。低劑量Apelin-13組造模同時每天予Apelin-13 1 μg/(kg·d)腹腔注射;高劑量Apelin-13組:造模同時予 Apelin-13 10 μg/(kg·d)腹腔注射;模型組和假手術組腹腔注射生理鹽水10 μg/(kg·d)，實驗時間均為4周。

1.3 各組血流動力學指標測定 2%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉各組大鼠，經右頸總動脈插入心導管，用生理儀測定大鼠左心室最大收縮壓(LVESP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)及左心室內最大升降速度(LV±dp/dtmax)。

1.4 血清 TGF-β1、BNP、MMP2、TIMP-1 測定 各組大鼠經右側頸總動脈插管處采集血液5 mL，以3 000 r/min離心10min，吸取上清液，EP管分裝，置于-20℃冰箱保存備用。應用ELISA法檢測血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平。

1.5 心肌細胞膠原的定性和半定量分析 將各組大鼠開胸取出心臟，取左室中段橫截面，4%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片Masson染色，用光學顯微鏡檢測心肌細胞組織學改變。采用圖像分析系統，測量心肌膠原容積分數(CVF)，每張心肌切片標本隨機取4個視野測量，取平均值。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，計量數據以±s表示，行t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

假手術組死亡1只，模型組死亡3只，低劑量Apelin-13組、高劑量 Apelin-13組均死亡2只。各組血流動力學指標檢測結果見表1，血清TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1水平比較見表2。假手術組、模型組、低劑量Apelin-13組、高劑量 Apelin-13組CVF分別為(7.96±0.44)%、(18.54.±0.86)%、(16.77±0.72)%、(10.23.±0.57)%，假手術組與模型組、低劑量Apelin-13組比較，P＜0.01，與高劑量Apelin-13組比較，P＜0.05;高劑量Apelin-13組與模型組比較，P＜0.01。

3 討論

目前MF的發生機制仍未完全明確，但大量研究表明［4～6］，神經內分泌系統激活導致的心肌重構及基質金屬蛋白酶(MMPs)與組織抑制因子(TIMP)平衡失調導致的膠原合成代謝和降解代謝失衡是MF發生、發展的重要機制。另一方面，臨床工作者們發現，ACEI及ARB類神經拮抗劑藥物雖然對抑制心肌重構有一定效果，但對MF的效果并不理想，此提示除腎素—血管緊張素(RAS)系統外可能有其他神經內分泌系統參與MF的形成與發展［7］。

表1 各組血流動力學指標比較(±s)

表1 各組血流動力學指標比較(±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01

組別 n LVESP(mmHg) LVEDP(mmHg) LV+dp/dtmax(mmHg/s) LV-dp/dtmax(mmHg/s)模型組 7 79±12* 18.8±4.2* 1 543±148* 1 637±146*低劑量Apelin-13組 8 82±9* 16.9±3.8* 1 702±224* 1 698±221*高劑量Apelin-13組 8 98±14＊△ 9.4±2.4＊△ 2 188±206＊△ 2 078±212＊△假手術組9 114±12 3.9±1.1 3 018±241 2 827±214

表2 各組血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平比較(±s)

表2 各組血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平比較(±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與低劑量 Apelin-13組比較，#P ＜0.05

組別 n TGF-β1(pg/mL) BNP(pg/mL) MMP-2(μg/L) TIMP-1(μg/L)MMP-2/TIMP-1模型組 10 67.89±3.27＊＊# 42.04±6.62＊＊# 11.78±1.32＊＊# 23.47±2.37＊＊# 0.50±0.06＊＊#低劑量Apelin-13組 10 58.78±2.15＊＊△ 38.76±4.31＊＊△ 13.70±2.14＊＊ 21.15±2.21＊＊△ 0.64±0.05＊＊△高劑量Apelin-13組 10 52.58±2.13△△# 30.28±4.42△△# 20.62±1.19△△# 16.81±1.31△△# 1.23±0.03△△#假手術組 10 45.36±2.08 24.35±2.36 24.31±1.13 12.63±1.08 1.92±0.05

Apelin/APJ信號系統是近年來新發現的信號系統，與RAS系統相似，Apelin/APJ信號系統在心血管系統高度表達，而其生理作用卻截然相反。研究表明［8］，在心力衰竭代償期內機體內源性Apelin表達增加，而在心力衰竭晚期其表達水平則降低。Japp等［9］研究發現，外源性給予Apelin能有效改善各種缺血性及非缺血性心臟病的心功能而不引起心肌肥厚。Apelin在心血管疾病的治療和預防中可能有更廣闊的前景。本研究結果顯示，應用腎上腹主動脈縮窄法誘導的心力衰竭大鼠血流動力學發生異常改變，左室肌纖維排列紊亂，可見大量膠原纖維變性，血管周圍亦可見反應性纖維化，CVF異常升高。而較大劑量腹腔注射外源性Apelin-13，大鼠血流動力學得到明顯改善，CVF有所降低，提示Apelin-13可減輕心肌損傷，有效阻止心肌纖維化。

近年來對Apelin的心臟保護作用機制研究日益增多，Apelin可能通過多種細胞因子和神經內分泌因子參與調節MF的形成和發展。TGF-β1是一種多功能的細胞因子，具有細胞轉化作用，其可抑制實質細胞增殖，促進間質細胞增殖及細胞外基質合成［10］。目前，TGF-β1 調節細胞增殖，促進纖維化的作用已得到多數學者認同，關于TGF-β1促進肺纖維化、腎臟纖維化、MF 等均有報道［11～13］。BNP 是近年來研究較多的一種神經內分泌因子，主要由心肌細胞分泌，當心室負荷加重時，BNP生成增加。研究證實BNP與心肌重構密切相關［14］。MMPs能降解細胞外基質，是心肌間質重建中基質降解的重要因素，而TIMPs是MMPs內源性特異性抑制劑。其中TIMP-1與MMP-2關系密切，且在心臟表達較多。本研究結果表明在大鼠心力衰竭模型中TGF-β1、BNP明顯升高，證實TGF-β1參與MF的發生與發展，此與大部分學者的研究結果一致，而BNP異常升高表明MF大鼠中存在神經內分泌系統異常。外源性給予Apelin-13后TGF-β1、BNP水平明顯降低，MMP-2明顯升高，TIMP-1明顯降低，MMP-2/TIMP-1接近正常。表明Apelin-13可能通過調節MMP-2/TIMP-1，抑制細胞外基質合成，促進心肌細胞外基質成分降解，抑制心肌重構及MF。

綜上所述，外源性給予Apelin-13可改善大鼠血流動力學，有效抑制 TGF-β1、BNP，調節 MMP-2/TIMP-1平衡，抑制MF，發揮心肌保護作用。此對于防治心力衰竭、降低血管疾病的死亡率有重要意義，亦對Apelin-13治療心臟疾病提供了新的依據。

［1］陳蓉，謝梅林.TGF-β/Smads信號通路在心肌纖維化發生和治療中應用前景的研究進展［J］.中國藥理學通報，2012，28(9):1189-1192.

［2］李麗英，魏雪梅，王偉，等.Apelin-APJ系統研究新進展［J］.重慶醫學，2011，40(22):2275-2278.

［3］Anversa P，Hagopian M，Loud AV.Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardiacInest hypertrophy［J］.Lab Inest，1973，29(3):282-292.

［4］謝亞芹，劉宏偉，李秀芬，等.轉化生長因子-β1和結締組織生長因子在慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化中的動態表達［J］.解剖學雜志，2011，34(4):446-449.

［5］趙凌杰，焦東東，趙智明，等.卡托普利對腹主動脈縮窄大鼠模型心?、窈廷笮湍z原及其mRNA表達的影響［J］.蚌埠醫學院學報，2010，35(11):1081-1084.

［6］陳蓉，謝梅林.葛根素對異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌纖維化的防治作用及機制探討［J］.山東醫藥，2012，52(15):20-22.

［7］Creemers EE，Pinto YM.Molecular mechanisms that control interstitial fibrosis in the pressure-overloaded heart［J］.Cardiovasc Res，2011，89(2):265-272.

［8］陳曦，趙永芳.丹參酮ⅡA對異丙腎上腺素致心肌缺血損傷大鼠apelin及其受體的影響［J］.中國藥物應用與監測，2012，9(1):18-21.

［9］Japp AG，Newby DE.The apelin-APJ system in heart failure:pathophysiologic relevance and therapeutic potential［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(10):1882-1892.

［10］馬麗娟，杜國利，呂文魁，等.氯沙坦鉀對2型糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-β1、CD68和MCP-1表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(5):947-950.

［11］官鍵，劉來昱，李啟生，等.TGF-β在放射性肺損傷大鼠肺組織中的表達及意義［J］.重慶醫學，2012，41(10):964-965.

［12］孫珉丹，陳志，馮野，等.TGF-β1基因多態性與IgA腎病病理改變間的關系［J］.中國實驗診斷學，2011，15(12):2122-2123.

［13］劉秀芳，王炳勝，李鳳玉，等.益氣活血中藥對放射損傷大鼠肺組織TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響［J］.現代腫瘤醫學，2010，18(8):1477-1480.

［14］毛福青，吳明星，何穩，等.N末端B型腦鈉肽前體在心力衰竭中的診斷和預后價值［J］.醫學臨床研究，2010，27(2):305-307.