10-羥基喜樹堿治療小鼠膠原誘導性關節炎

王 燕，魏永鴿，胡曉舟，胡慧華，邢華燕，張 燕，牛 琳，杜 柯

(1鄭州大學第五附屬醫院，鄭州450052;2鄭州鐵路職業技術學院)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以對稱性多關節炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。持續的滑膜炎可導致關節內軟骨和骨的破壞，導致關節功能受限。目前雖然針對RA的治療方法較多，如采用免疫抑制劑、激素、細胞因子拮抗劑、阻斷T-B細胞接觸的信號途徑等［1～3］，但療效并不理想，且不良反應大，因此，尋找療效好、不良反應少的新型治療藥物一直是RA治療領域的熱門話題。10-羥基喜樹堿(HCPT)不僅僅可以通過抑制細胞增殖而產生較強的抗腫瘤作用，同時還可以抑制淋巴細胞活性，減少機體異常的免疫反應，這提示HCPT理論上能控制RA疾病的發展。因此，本研究采用膠原誘導性關節炎(CIA)動物模型對HCPT的免疫調節作用進行了初步探討。為了研究HCPT在CIA發病中的免疫調節機制，我們通過對CIA小鼠的干預實驗、關節炎評分、CⅡ特異性T細胞增殖實驗以及小鼠外周淋巴結T細胞亞群和細胞因子的檢測來初步證實HCPT能否應用于RA的預防治療，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為6～8周的雄性DBA/1小鼠30只。主要試劑:雞源性Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ，純度＞99%)購于Chondrex公司;Western blot實驗抗體均購自 Cell Signaling公司;不完全弗氏佐劑(IFA)和熱滅活結核分枝桿菌(TB)購于DIFCO公司;RPMI1640培養液、胎牛血清購于Gibco公司。HCPT:5 mL(10mg/支)。

1.2 方法

1.2.1 CIA模型的建立、分組及干預 將小鼠分為正常對照組、CIA陽性對照組、HCPT治療組，每組10只。CIA陽性對照組和HCPT治療組每只小鼠經尾根部2～3cm處皮下注射100 μL乳化抗原，并在第21天經小鼠背部兩側皮下注射CⅡ溶液和等量的IFA乳化后的抗原進行免疫加強。HCPT治療組從第1天至第20天同時予HCPT 5mg/(kg·d)，腹腔注射，每日1次;正常對照組及CIA陽性對照組予相同劑量的生理鹽水，每日1次。

1.2.2 關節炎評分 無異常變化為0分;踝關節有輕微的發紅和腫脹，或個別足趾紅或腫為1分;踝關節有中度紅斑及腫脹為2分;爪子(包括足趾)出現嚴重的腫脹和紅斑為3分;多關節的重度腫脹和關節畸形為4分。關節炎評分為每只小鼠四肢評分之和。

1.2.3 組織病理學分析 處死小鼠，分離膝關節、固定(10%甲醛)、石蠟包埋、切片，然后進行HE染色，并在顯微鏡下觀察病灶炎性細胞浸潤程度，分析各組小鼠的組織病理學進展。

1.2.4 HCPT干預后CⅡ特異性T細胞增殖能力檢測 行CⅡ特異性T細胞增殖實驗。取CIA小鼠脾臟制成單細胞懸液，調整細胞數為5×106/mL，分別加入0、5、10、20 μg/mL 的 CⅡ刺激，并于37 ℃、5%CO2培養箱培養48～56 h，然后每孔加入1 μCi的放射性同位素H3-TdR，繼續培養至72 h，抽膜、洗板、加入閃爍液后讀取Cpm(微居里)值。

1.2.5 小鼠外周淋巴結T細胞亞群檢測 取發病高峰期小鼠的淋巴結制備成單細胞懸液，加入流式熒光抗體(購于BD、eBioscience公司)，通過胞內染色分別標記Th1、Th17細胞和Treg細胞，從而檢測各細胞群的表達水平。

1.2.6 IFN-γ、IL-17、TGF-β 的檢測 將各組小鼠脾臟制備成單細胞懸液(1×107/mL)，每組細胞懸液中加入20 μg/mL的CⅡ，并于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h收集上清。用 ELISA方法檢測，由eBioscience公司提供。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量資料以±s表示，比較行t檢驗;計數資料比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組關節炎評分和組織病理學觀察結果HCPT治療組關節炎評分明顯低于CIA陽性對照組，尤其在患病高峰期，其評分遠低于CIA陽性對照組。組織病理學分析示HCPT治療組小鼠關節的炎性細胞浸潤程度遠小于CIA陽性對照組，且軟骨的破壞亦不如CIA陽性對照組明顯。在初次免疫后45～50 d左右，小鼠的病情均有所緩解，但HCPT治療組小鼠的關節炎評分仍明顯低于CIA陽性對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 HCPT干預后關節炎評分

2.2 各組CⅡ特異性T細胞增殖能力檢測結果HCPT處理后CⅡ特異性T細胞的增殖明顯受抑(圖2)，在 CⅡ 5、10 及20 μg/mL 時，HCPT 組 T 細胞增殖能力均明顯低于CIA陽性對照組，P均＜0.05。正常對照組、CIA陽性對照組、HCPT治療組的平均 CIA/HCPT比值分別為18.648±1.172/33.45±1.532、18.349±0.946/30.251±0.935、15.553±0.873/27.050±0.676。

2.3 各組小鼠外周淋巴結T細胞亞群及IFN-γ、IL-17、TGF-β的檢測結果 正常對照組、CIA陽性對照組、HCPT治療組炎癥細胞Th1水平分別為0.813±0.073、1.808±0.075、1.055±0.103，Th17分別為1.561±0.112、5.712±0.269、3.806±0.375，Treg細胞百分比分別為78%、93%、74%，IFN-γ水平分別為830.4±31.479、2130.1±231.275、1630.0±128.949，IL-17水平分別為 80.0±8.124、170.1±12.087、170.1±12.087，TGF-β 水平分別為330.2±14.853、120.5±5.148、299.9±14.828，正常對照組與CIA陽性對照組及CIA陽性對照組與HCPT治療組比較，P均＜0.05。

圖2 HCPT對CⅡ特異性T細胞亞群增殖能力的影響

3 討論

RA是一種常見的致畸性系統性自身免疫性疾病，全世界約有1%的人患有此病，而我國人群患病率0.24%～0.40%，各期RA患者超過500萬人。該病臨床表現多樣，患者多在發病2年內即可出現不可逆的骨關節破壞，最后將導致關節強直、畸形和功能喪失。目前其病因和發病機制尚未闡明，據有關研究表明，RA發病與T淋巴細胞功能密切相關，而RA的治療長期以來主要依靠免疫抑制劑如甲氨蝶吟、來氟米特、環孢素A及硫唑嘌呤等［4］，這些藥物雖然在一定程度上可以控制RA的病情進展，但其毒副作用較大(如肝腎毒性及骨髓移植等)，因而在很大程度上限制了上述藥物的臨床使用。

近年研究發現，RA是一種具有增生性和破壞性的類似局部性惡性腫瘤的疾病，鑒于此特點，某些抑制腫瘤增殖的藥物有望用于RA的治療。HCPT可通過抑制細胞增殖而產生較強的抗腫瘤作用，同時還可以通過抑制淋巴細胞的活性，進而抑制機體的異常免疫反應，因此，在理論上HCPT能夠起到控制RA疾病發展的作用，我們的前期工作亦證實了這種推測。所以HCPT有望成為治療RA的新型藥物。但目前尚無關于HCPT如何抑制RA滑膜炎癥的報道，我們在CIA模型中對上述機制進行了初步探討。

CIA模型是一種免疫炎癥模型，其特征是多發性關節炎，發病機制和病理特征與人類RA相似，該模型的一個顯著的特點是T淋巴細胞、B淋巴細胞對CII均有過度應答［5］。本研究結果顯示，HCPT不僅可以明顯推遲CIA小鼠的發病，而且在發病過程中，HCPT治療組小鼠的關節炎評分明顯降低，小鼠關節切片中，炎癥細胞浸潤的程度亦明顯降低，軟骨破壞程度明顯減輕。從增殖實驗分析，HCPT治療組小鼠CⅡ特異性T細胞對CⅡ的反應明顯下降。上述結果提示HCPT可抑制CⅡ特異性T細胞的反應能力。

另外我們還發現，在CIA發病初期，滑膜中就可以分離出Th1及Th17細胞，提示這些細胞可能是介導炎癥發生的關鍵，并且和炎癥的嚴重程度有關［6～9］。IL-10 和 TGF-β 主要來源于 Treg 細胞，在RA關節的滑膜中，Treg細胞生成明顯減少［10］。研究發現，RA外周血中Treg雖然可以抑制炎性細胞增殖，但未抑制IFN-γ及IL-17的產生。通過檢測不同組小鼠體內Th亞群的變化發現，HCPT治療組小鼠體內Treg細胞在CD+4T細胞中的百分比明顯增高，在體外其分泌細胞因子TGF-β的能力顯著增強，而Th1、Th17細胞在HCPT治療組中的表達下降，分泌炎癥因子的能力被抑制。以上結果均表明，HCPT預先干預CIA小鼠可誘導小鼠產生免疫抑制效應，進而降低免疫系統對CII抗原的敏感性，從而抑制疾病的發生發展。

綜上所述，HCPT治療小鼠CIA效果較好，其可通過抑制自身反應性T細胞增殖，上調體內Treg細胞并抑制Th1、Th17細胞的表達而發揮免疫調節作用，有效降低CIA小鼠發病嚴重程度，改善關節炎癥。本研究為HCPT治療自身免疫性疾病提供了新的理論依據。

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